2020 Fiscal Year Annual Research Report
膜融合異常によるパラミクソウイルスの新規感染動態の機構解明とその制御
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20H03497
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
橋口 隆生 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 教授 (50632098)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 膜融合 / ウイルス学 / 構造生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エンベロープを持つウイルスによる細胞侵入・細胞および組織指向性は、ウイルスが持つ糖蛋白質と細胞表面に存在する受容体との結合およびウイルスエンベロープと細胞膜の膜融合の連鎖反応により厳密に制御されている。通常、ウイルスの細胞および組織指向性は受容体やプロテアーゼ等宿主因子との相互作用に依存し、膜融合という現象自体は単にウイルスエンベロープと細胞膜を融合させる補助的な役割と捉えられていた。しかし、我々を含む複数の研究により、膜融合能変化に伴う異常な細胞/組織指向性の獲得機構が存在することが近年示された。そこで、本研究では、”膜融合”をキーワードに、パラミクソウイルス感染症における異常膜融合機構の全体像を原子・分子・細胞レベルで明らかにすることを目的に研究を行っている。
本年度は、網羅的な変異体解析などを中心に膜融合能変化に伴う異常な細胞/組織指向性の獲得を可能にする新規変異体の探索を実験的手法と計算的手法でそれぞれ独立して行った。また、ウイルス受容体蛋白質とウイルス膜融合蛋白質の相互作用を定量化することを目指して、それぞれの蛋白質の発現・精製を行い、免疫沈降法や表面プラズモン共鳴などの手法により結合力の測定を行うために必要な精製蛋白質の調整を行った。また、パラミクソウイルス感染の制御手法の研究として、化合物ライブラリーを用いた細胞侵入阻害剤のスクリーニング系を構築し、初期スクリーニングを実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は以下の実験項目を行った。
(1) 網羅的な膜融合能変異体の抽出・解析：構造上どの領域に変異が生じることが膜融合能亢進に重要か統計的に決定するため、膜融合能亢進変異体の網羅的な探索を行う。膜融合能の亢進度合いにより神経系細胞間伝播の速度が異なるので、神経症状の進行度の予測に役立つと期待される。本年度は、アミノ酸配列と構造情報を基に複数のアミノ酸残基間の進化情報の相関を考慮し、膜融合能に関与するアミノ酸変異を統計的に算出した。さらに、実験のみによる同定法として、F蛋白質へerror-prone PCRを利用してランダム変異を導入し、変異ウイルスライブラリーをリバースジェネティクス法により作成した。
(2) 異常膜融合能を示す融合蛋白質の構造解析：膜融合能亢進変異体では、熱力学的な性質が異なるため、野生型とは異なる構造変化が起きていることが確実視される。従って、どういった構造変化が膜融合亢進を引き起こすのかを構造解析し、神経病原性の理解につなげる。本年度は、膜融合能亢進変異体の構造解析を行った。変異体の精製蛋白質は野生型に比べ、蛋白質科学的な性質が悪く、凝集しやすい性質であることが明らかとなった。
(3) 膜融合能亢進ウイルスに対する感染阻害機構の解析：膜融合能亢進ウイルスによる神経感染などへの異常な細胞/組織指向性の制御を目的に、化合物ライブラリーを用いて感染阻害分子を探索し、阻害機構を解明する。本年度は、パラミクソウイルス糖蛋白質の構造情報と東大創薬機構の化合物ライブラリー（約23万化合物）を利用して膜融合阻害候補のin silico選抜（約1000化合物への絞り込み）と初期スクリーニングを行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は以下の項目について実験を実視し、研究を推進する。
(１) 網羅的な膜融合能変異体の抽出・解析：本項目については、パラミクソウイルス膜融合蛋白質へerror-prone PCRを利用してランダム変異を導入して作製した変異ウイルスライブラリーからRNA-seq解析により変異候補を選抜し、膜融合能の増減に影響を及ぼす変異体を評価・解析する。
(２) 異常膜融合能を示す融合蛋白質の構造解析：本項目については、来年度も引き続き膜融合能亢進変異体の構造解析を行う。主に、X線結晶構造解析および進歩が著しい高分解能cryo電子顕微鏡解析を用いる。
(３) 膜融合能亢進ウイルスに対する感染阻害機構の解析：本項目については、2次・3次スクリーニングを実施し、阻害化合物の絞り込みと再現性の確認、細胞毒性の解析を行う。
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Research Products
(5 results)
