2020 Fiscal Year Annual Research Report
IgAによる腸内共生細菌の維持調節メカニズムの解明
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20H03506
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
鈴木 敬一朗 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 客員研究員 (90391995)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | IgA / 糖鎖 / 腸内細菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腸管内には多種多様な常在細菌が存在し、生体恒常性を維持するための重要な役割を果たしている。IgAは腸管内に大量に分泌されて、病原菌の排除と常在菌の定着・増殖という一見相反する作用の両方において重要な役割を担っている。我々の過去の研究によってIgAの糖鎖は常在細菌との結合に重要な役割を果たしており、常在細菌が腸管粘膜上で宿主との共生作用を発揮できるように支持している事が示唆されている。本研究では、IgA上の糖鎖と腸内細菌間の複雑な相互作用の詳細について明らかにする目的でIgAの糖鎖を測定できるIgA-糖鎖-ELISA法を開発した。プレート上に固相化した抗IgA抗体で生理的な腸管IgAを キャプチャし、次にビオチン化したレクチンを用いて糖鎖成分を定量する方法である。この方法を用いて様々なIgA上の糖鎖を測定したところ、以下の3点が明らかとなった：1.T細胞欠損マウスと野生型マウスの腸管IgA糖鎖プロファイルは異なっている 2.IgA形質細胞から培養液中に放出されたIgAと糞便IgAの糖鎖プロファイルは異なっている 3.正常マウスと抗生物質を飲用させたマウスの糞便IgA糖鎖プロファイルは異なっている。以上より、IgAの糖鎖プロファイルに影響を与える因子は少なくとも1.T細胞の作用 2.腸管上皮からの分泌時に付与される分泌因子 3.腸内細菌の作用 の３点が存在する事が明らかとなった。本研究では、さらに異なる糖鎖プロファイルを持つIgAがどのような種類の腸内細菌と結合するのかについての解析を進め、IgAと腸内細菌の結合性について詳細な解析を進めている。さらには、IgAの糖鎖と結合する腸内細菌を無菌マウスに定着させることにより、IgA糖鎖が腸内細菌を介して生体恒常性を維持するメカニズムについて理解することを目指している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年度の研究は、新たにセットアップしたIgA-糖鎖-ELISA法を用いて様々な異なる条件下において産生されたIgAの糖鎖プロファイルを測定することから開始した。その結果、IgAの糖鎖は我々が当初予測していたよりも多くの環境要因によって調節されている事が明らかとなった。また、それぞれの環境要因によって調節される糖鎖の種類も異なる事が判明し、糖鎖によって付加されるIgAの機能は複雑なバリエーションを持つ事が推察された。本研究に取り組む前の予備実験の段階において、我々は特定の糖鎖Xに着目し、糖鎖Xと腸内細菌との結合性について検証を加えることを計画していた。しかし、糖鎖プロファイリングの結果は我々が予想していたよりも高度な複雑性を示しており、一つの糖鎖に特化した解析を行うことはIgA糖鎖の生理的な意義について正確な知見をもたらさない可能性が示唆された。そこで、糖鎖Xのみならず、様々な種類の糖鎖を切断する酵素を用いてIgAの糖鎖切断を行い、試験管内で腸内細菌と反応させる実験を進める事とした。この実験を進める途中で新型コロナウイルス感染症の蔓延により研究の中断を余儀なくされたが、入手可能な糖鎖切断酵素の多くを用いてIgAの糖鎖切断方法を確立する事ができた。この方法を用いてIgA糖鎖を操作して試験管内で腸内細菌との反応させた後にフローサイトメトリーを用いて反応性を確認する段階まで研究を進める事ができた。2020年度の研究は若干の方向性の修正を加えておおむね順調に進展した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究では、腸内細菌と結合性の高いIgAの糖鎖構造を見極めていく事が一つの目標となる。この研究項目では、なるべく生理的かつ一定の条件下におけるIgA-腸内細菌の結合性を測定する事が必要である。この目的で、IgAとRag1欠損マウスの糞便から抽出した腸内細菌群を試験管内で反応させる実験系を用いる。Rag1欠損マウスの糞便細菌を用いるのは、培養細菌よりも生理的な条件下で維持される菌群である事と、通常マウスで認められる菌体表面に結合したIgAが存在しない事が理由である。この実験系において様々な糖鎖構造を持つIgAを使用してRag1欠損マウス糞便細菌群との結合性を比較する。比較群として以下の組み合わせが考えられる：1.野生型マウスの糞便IgAとT細胞欠損マウスの糞便IgA 2.腸管IgA産生形質細胞の培養上澄（腸管上皮から分泌される前の分泌因子が付与されていないIgA)と糞便IgA（腸管上皮から分泌された後の分泌因子が付与されたIgA) 3.通常マウスと抗生物質を飲用させたマウスの糞便IgA 4.通常マウスの糞便IgAにおいて糖鎖切断酵素処理をおこなったものと未処理のもの。これらの異なる糖鎖構造を持つIgAがRag1欠損マウス糞便細菌群にどの程度結合するのかをフローサイトメトリーを用いて測定する。IgA-腸内細菌の結合性に明らかな差が認められた場合には、IgAに結合した細菌群をフローサイトメトリー下で単離し、次世代シーケンサーを用いて細菌種の同定を行う。これらの実験を行うことによって、腸内細菌との結合に必要とされるIgAの糖鎖について知見を得ることを目標とする。
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