Investigating the mechanisms of B cell lymphomagenesis driven by MYD88 and CD79B mutations

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H03518
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 堀川 啓介 熊本大学, 国際先端医学研究機構, 客員准教授 (60313095)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 滝澤 仁 熊本大学, 国際先端医学研究機構, 特別招聘教授 (10630866)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 悪性リンパ腫 / B細胞 / がん遺伝子 / 点突然変異 / シグナル伝達

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、新規作製したCD79B変異マウスを利用して、悪性リンパ腫で多発するMYD88-L265P変異とCD79B-Y196H変異がどのように協調的に作用し、B細胞を癌化させるようなシグナルを伝達するのかを解析している。本年度の予定であった目的3A、「MYD88L265PとCD79BY196H変異により協調的に誘導される遺伝子の同定」を行った。

野生型またはCD79B-Y196H変異をもち、トリ卵白リゾチーム（hen egg lysozyme, HEL）を特異的に認識する免疫グロブリントランスジェニックマウスを実験に使用した。それぞれのマウスからの活性化B細胞にMYD88野生型、MYD88-L265P変異を発現するようにレトロウィルスを感染させた。遺伝子導入後のB細胞を増殖因子なしの状態にした後、抗原HEL存在・非存在下では24時間培養し、GFP陽性細胞からRNAを単離した。2度の独立した実験を行い、RNAシークエンスによる遺伝子発現解析を行った。NFκB転写因子の活性化を示す遺伝子群（CD21、CD25など）の発現上昇が、MYD88-L265P変異の遺伝子導入に特徴的にみられた。また、B細胞抗原受容体刺激後に上昇することが報告されている遺伝子群（Egr、Nur77/Nr4a1など）が、抗原HEL刺激の影響によって発現上昇していた。現在、MYD88-L265P変異とCD79B-Y196H変異の遺伝子導入によって細胞に特異的に増加・減少している遺伝子群のリストからリンパ腫の増殖・生存に重要だと想定される遺伝子の絞り込みを行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2度の新型コロナウイルス感染による大学キャンパス閉鎖（2020年4月-6月、2020年8月-10月）により実験が途切れたこと、またそれによるマウス飼育の制限によって実験計画を大きく変更しなくてはならなかった。そのため、計画していた目的2のMYD88L265PとCD79BY196H変異によるB細胞の機能異常の解析を満足に行えなかった。しかし、もうひとつの目的であったRNAシークエンスによる遺伝子発現解析が実施できたこと、またそのデータ解析により実験系が正しく動いていることが確認できたこと、またそのデータにより目的3Bの実験に必要な候補遺伝子群の作成ができたこと、以上により「おおむね順調」と評価した。

Strategy for Future Research Activity

2021年度に、CD79B-Y196H変異とMYD88-L265Pの遺伝子導入によってB細胞にどのような遺伝子発現変化が起きるのかを調べるために、RNAシークエンスによる探索的な遺伝子発現解析を行った。本年度、上記2つの変異遺伝子導入による悪性リンパ腫の発生機序の解析を行う。
目的3A MYD88L265PとCD79BY196H変異により協調的に誘導される遺伝子の同定
RNAシークエンスによる遺伝子発現を確認を行う。いくつかの候補を絞り、遺伝子発現変化をRT-PCR、タンパク質レベルでの変化をウェスタンブロッティングやフローサイトメトリー（細胞外および細胞内染色）で行う。
目的3B MYD88-L265PとCD79B-Y196H変異を標的とする候補遺伝子の絞り込みと検証
MYD88-L265PとCD79B-Y196H変異を併せもつABC-DLBCL細胞株として、HBL-1とTMD8の2つの細胞株が存在する。
この2つの細胞株の増殖・生存に必要な遺伝子に関するCRISPRスクリーニングのデータが公開されている (Reddy et al., Cell 2017; Phelan et al., Nature 2018)。これらの公開されたデータと、RNAシークエンスを比較し、MYD88-L265PとCD79B-Y196H変異を有するリンパ腫の増殖・生存に重要と想定される標的遺伝子の絞り込みを効率的に行う。候補遺伝子が実際にMYD88-L265P/CD79B-Y196H変異による悪性化シグナルに重要かどうかを確認するために、ドキシサイクリンでshRNA発現を誘導できるレンチウィルスベクターを作製する。作製したレンチウィルスを上記の2つのABC-DLBCL細胞株に感染させ、候補遺伝子のノックダウンによるリンパ腫細胞の増殖・生存への影響を検証する。