2020 Fiscal Year Annual Research Report
Envolvement of abnormal of SETDB-related histone modification enzyme and tumor immune environment in gastrointestinal cancer
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20H03526
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
秋山 好光 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (80262187)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
新部 彩乃 (樺嶋) 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (20445448)
島田 周 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (20609705)
田中 真二 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (30253420)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | エピジェネティクス / ヒストン修飾 / 消化器癌 / 腫瘍免疫環境 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
SETDB1とSETDB2はヒストンH3の9番目のリジンに対するヒストンメチル基転移酵素である。これら２つは様々な悪性腫瘍で発現亢進し、癌の悪性度や予後に関連するが、有効な治療法は未だに確立されていない。ヒストン修飾因子は様々な因子と複合体を形成して遺伝子発現制御に働くが、SETDB型ヒストン修飾酵素の複合体は不明な点が多い。現在、SETDB1とSETDB2はT細胞やマクロファージでも発現変化が報告され、炎症・免疫環境との関連も示唆されている。本研究では様々な消化器癌でSETDB2とSETDB1の発現について比較する。更に遺伝発現制御に関する複合体形成の解析および腫瘍免疫環境の面から役割を検討し、両者の機能的類似点と相違点を明らかにする。
本研究計画では、初年度はin vitroを中心とし、2年目以降はそれを継続しながら、in vivo実験系を遂行する。これまでの研究成果として、レンチウイルス発現系を用いてSETDB1とSETDB2の安定発現細胞株を複数の細胞株で樹立した。さらに免疫沈降解析によりSETDB2に結合するエピゲノム因子を明らかにしたので、引き続きその複合体の機能やSETDB1結合因子との違いを検討中である。またSETDB2の機能としてとがん幹細胞性に関わる可能性が認められた。SETDB1とSETDB2の機能を解析するため、それらのsiRNAでノックダウン実験を進めている。同様にCRISPR/Cas9システムを用いてノックアウト細胞株の樹立を試みた。胃癌組織、肝胆膵難治性癌組織を収集し、免疫組織染色にてSETDB型タンパク質の発現異常を検討中である。胃癌組織から解析を進めており、SETDB2とSETDB1発現亢進が検出された。同様に、CD4やCD8などの免疫細胞の染色も進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はSETDB型タンパク質についてin vitro側からの研究を行った。レンチウイルス発現系を用いた複数の胃癌細胞株でFLAGタグまたはHAタグを導入したSETDB2安定発現株を作成した。SETDB2-FLAG発現細胞株を用いて免疫沈降解析を行い、エピゲノム関連因子XがSETDB2と結合することを明らかとした。またSETDB2と癌幹細胞性の検討を進めており、癌細胞をSphere formation assayでsphereを作らせて培養するとSETDB2発現がタンパク質レベルで亢進することが示唆された。さらにSETDB1安定発現細胞株も樹立できたので、今後、SETDB2結合タンパク質との機能的な違いについて検討できる実験系が確立できた。一方、CRSPR/Cas9システムを用いて、胃癌細胞でノックアウト(KO)細胞の樹立を試みたが、樹立した細胞株はシーケンスとWestern blotでヘテロにKOされており、ホモ欠損細胞は樹立できなかった。今後はCRISPR/Cas13などの別の系によるSETDB2発現抑制株の樹立を進めることになった。
胃癌および肝胆膵難治性癌のパラフィン切片を収集し、SETDB1/2の発現を免疫組織染色で調べている。胃癌組織ではおよそ30%で発現亢進していることを以前、報告しているが、SETDB1も同様に発現亢進していた。抗体の確認や染色条件の検討を行い、有効な条件が確立できたので、現在、症例を増やしてSETDB1, SETDB2および免疫細胞表面マーカー発現解析の発現解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度のin vitro系の研究を継続し、in vivo実験系を開始する。
1)SETDB型タンパク質の機能と組織内発現状況の解析を継続する。レンチウイルス発現系実験で作成したヒトSETDB1, SETDB2安定発現癌細胞株を用いてRNA-seqとクロマチン免疫沈降(ChIP)解析を進め、標的遺伝子の共通性や違いを明らかにする。またSETDB2が他のエピジェネティクス構成因子Xと結合することが明らかになったので、その複合体の分子メカニズムを解析する。さらにLC-MS/MS解析によるSETDBタンパク質結合因子の網羅的探索を進める。現在、進行中のSETDB遺伝子ノックダウン細胞株を完成させ、機能解析を行う。胃癌および他の消化器癌の臨床検体数を追加して、SETDB1, SETDB2発現と免疫細胞表面マーカー発現解析を進め、臨床病理学的諸性状との関連を明らかにする。
2)SETDB型タンパク質の造腫瘍性および腫瘍内微小環境への関与を調べる。ヒトSETDB1, SETDB2の安定発現細胞株をヌードマウスへ移植し、造腫瘍性獲得の有無を調べる。さらにC57BL/ 6Jマウス由来胃細胞と肝細胞を用いてマウスSETDB1またはSETDB2を高発現する細胞株を作成して、同系C57BL/6J正常マウスへの移植実験を開始する。腫瘍ができた場合は、RNA-seq解析および組織内の免疫細胞表面マーカー発現状況の解析を行い、どの変化が免疫回避に関与するかを検討する。腫瘍ができなかった場合は、C57BL/6Jマウス皮下で腫瘍形成する既知のマウス癌細胞および我々が樹立したがん抑制遺伝子Yをノックアウトさせることで腫瘍形成する細胞株を用いる。これらの細胞にSETDB1またはSETDB2を高発現させて、腫瘍内微小環境の変化を明らかにする。
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[Journal Article] Loss of ARID1A induces a stemness gene ALDH1A1 expression with histone acetylation in the malignant subtype of cholangiocarcinoma.2020
Author(s)
Yoshino J, Akiyama Y, Shimada S, Ogura T, Ogawa K, Ono H, Mitsunori Y, Ban D, Kudo A, Yamaoka S, Tanabe M, Tanaka S.
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Journal Title
Carcinogenesis
Volume: 41
Pages: 734-742
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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