2020 Fiscal Year Annual Research Report
Maximizing the cancer diagnostic information contained in large extracellular vesicles
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20H03538
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| Research Institution | Japanese Foundation for Cancer Research |
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Principal Investigator |
芝 清隆 公益財団法人がん研究会, がん研究所 蛋白創製研究部, 部長 (40196415)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大木 暁 公益財団法人がん研究会, 有明病院 消化器化学療法科, 医長 (50348546)
杉山 裕子 公益財団法人がん研究会, 有明病院 細胞診断部, 部長 (80322634)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞外小胞 / 液性診断 / エクソソーム / がん |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞が放出する細胞外小胞は、細胞・組織間コミュニケーションの主役的立場にあり、特にがんの発生・進展・悪性化に重要な役割を果たす。しかしながら、細胞外小胞は極めて多様性に富む集団で、その全体像はいまだに把握されていない。これまでの細胞外小胞研究が、小さな細胞外小胞（エクソソームと呼ばれることが多い）にバイアスがかかっていたことを鑑み、本研究では大きな細胞外小胞も含めた、体液中の細胞外小胞の全体像を把握することから始め、これまであまり解析の進んでいなかった「大きな細胞外小胞」からの細胞内診断情報の引き出しの可能性を追究しつつある。同時に、大きな細胞外小胞の生成機構などの解明を目ざしている。
これまでの研究で、唾液（健常者、および口腔がん患者由来）が含む各種微粒子を差分遠心法で展開し、各分画の含む細胞外小胞マーカーの存在分布を観察したところ、特に大きな細胞外小胞を含む分画で、興味深い発現パターンが観察された。具体的には、がん化に伴い発現が亢進することが知られている膜タンパク質類の、分子量の小さい派生体が、大きな細胞外小胞を含む分画に存在していた。また、オートファジー関連タンパク質のあるものが、これまでに報告が無いフォームで大きな細胞外小胞を含む分画から観察された。
差分遠心法で調製される分画の、特に大きな細胞外小胞を含む分画には、電子顕微鏡観察からは、いろいろな形態の細胞外小胞が観察され、さらなる差分化が必要なことがわかった。そこで、この分画を密度勾配中を非平衡で遠心移動させ、高解像度に大きな細胞外小胞をサブクラスに分離し、解析する実験条件の確立に成功している。これらの取り組みから、その理解が遅れていた大きな細胞外小胞に関する知識の蓄積が進み、新たな細胞外小胞研究の展開が期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
健常人、口腔がん患者の体液全体を、差分遠心法で「0.3K]「2K]「10K」「100K」「SUP」の5分画に分け、それぞれの分画の特徴の、分子生物学的な解析を完了した。
「2K」「100K」「SUP」などに、口腔がんの診断情報取得につながる特異的なマーカー分子の動きが観察されたが、本研究では、特にこれまであまり研究が進んでいない「大きな細胞外小胞」を含む「2K」を中心に、予定通り解析を進めることにしている。
「2K」分画が含む大きな細胞外小胞は、光学顕微鏡でも観察可能な大きさであるので、通常のパパニコウル染色により、細胞外小胞を失わない状態でガラス板に固定・染色し、顕微鏡画像を多数取得し、AIによる分類をおこなう機械学習環境の構築をほぼ完了している。
「2K」が含む各サブクラスの細胞外小胞を、さらに詳細に解析するために、「2K」分画を、密度勾配メディア中を、（密度に関しては）非平衡条件下で移動させ、注目している分子が濃縮される実験条件を見いだすことに成功した。
「2K」分画には、オートファジーに関連した分子が濃縮しているのが特徴で、ある種の分子は、これまでの報告されていない分子フォームで存在している。この特徴的な分子フォームが実験上のアーティファクトではないことを示すために、いろいろな条件下での解析をおこなった。調べた条件下では、安定してこの特異的なフォームが、全ての検体から観察された。コントロールで比較した、培養細胞株や血漿、血清からは、これらのフォームは検出されなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度で確立した、「大きな細胞外小胞を含む分画を解像度良く解析する解析手法」を用い、2021年度は次のような研究を計画している。
（1）「2K」分画が含む細胞外小胞をさらにいくつかのサブクラスに分けて整理すること。（2）各サブクラスが運ぶ分子マーカーを解析し、その生成経路に関する知見を蓄積すること。具体的は、いわゆるエクソソームマーカーといわれているタンパク質に加えて、オートファジー関連の各種マーカーを用いたウェスタンブロッティングをおこない、必要に応じて、免疫共沈殿実験、プロテオーム解析、核酸解析をおこなう。（3）口腔内がん患者に特徴的ながんマーカー派生体が、（1）で調べた大きな細胞外小胞のどのサブクラスにより運ばれているかを決定し、がん進展の分子機構と併せて考察すること。必要ならば、これらの分子が細胞外小胞の中に存在するのか、外に存在するのかの情報を、生化学的な実験から取得する。
さらに（4）として、（1）-(3）で得られた知見をもとに、特にがん化にともない動きのある大きな細胞外小胞を特異的に光学顕微鏡（蛍光観察も含める）で同定できる条件を探索し、高価な機器を必要としない「細胞外小胞診」の創成につながる基盤を技術を確立することをめざす。
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Research Products
(3 results)
