2022 Fiscal Year Annual Research Report

The new strategy for radioresistance in cancer associated with p53 mutation using targeted alpha therapy

Research Project

Project/Area Number	20H03633
Research Institution	National Institutes for Quantum Science and Technology
Principal Investigator	坂下哲哉国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所量子バイオ基盤研究部, 上席研究員 (30311377)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	大島康宏国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所放射線生物応用研究部, 主幹研究員 (00588676) 松本義久東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (20302672) 河野暢明慶應義塾大学, 政策・メディア研究科(藤沢), 准教授 (90647356) 有田隆也名古屋大学, 情報学研究科, 教授 (40202759)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	標的アイソトープ治療 / p53 / アルファ線 / 悪性褐色細胞腫
Outline of Annual Research Achievements	がん抑制遺伝子p53は、重要ながんの治療標的分子である。211At標識メタアスタトベンジルグアニジン（以下MABG）は、p53変異がん細胞にも有効である可能性があり、部分的にp53野生型のがんと共通する殺細胞経路の存在も予想される。しかし、これまでにp53変異の有無に対応付けられたα線内用療法の殺細胞メカニズムの研究例はない。そこで、本研究では、「α線内用療法でp53変異型の放射線抵抗性がんを克服できる可能性とその分子メカニズムを明らかにし、新たな治療戦略を、具体的な治療標的分子や細胞死誘導経路の知見から創出する」ことを目的とする。具体的には、（１）培養細胞の解析では、p53野生型のSK-N-SH細胞、及びp53変異SK-N-BE(2) 培養細胞のMABG処置後の生存率曲線をMTT試験により求めた。また、SK-N-BE(2)細胞のコロニー試験の検討を進め、MABG処置細胞についてコロニー観察に成功した。今年度に予定していたSK-N-BE(2)細胞のγ線照射実験は翌年度に繰越した。（２）p53変異細胞株の作製においては、ゲノム編集によりヒト由来細胞を用いた細胞株の作製を進めた。また、作製株のノルアドレナリントランスポーター(NET1) の発現の検討を進めた。（３）殺細胞メカニズムの探索では、MABG処置した細胞のシングルセル解析試料についてRNAシーケンス解析を実施できた。加えて、２次解析としてバイオインフォマティクスツールを用いて、発現有意遺伝子（DEG）の解析整備ができた。（４）動物実験による解析では、PC12腫瘍細胞株の担がんマウスを用いて、シングルセル化の検討を行った。以上、一部実験を翌年度に繰越したが、ほぼ予定通りに進んでいる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason （１）培養細胞（神経芽腫由来SK-N-SHおよびSK-N-BE(2)細胞）の解析：　培養細胞を用いた解析では、昨年入手したヒト由来神経芽腫のSK-N-BE(2)腫瘍細胞を中心にして進めた。p53野生型のSK-N-SH細胞、及びp53変異SK-N-BE(2) 培養細胞のMABG処置後の生存率曲線をMTT試験により求めた。また、SK-N-BE(2)細胞のコロニー試験の検討を進め、MABG処置細胞についてコロニー観察に成功した。今年度に予定していたSK-N-BE(2)細胞のγ線照射実験は翌年度に繰越した。（２）p53変異細胞株の作製：同一遺伝的背景においてp53機能がMABG感受性にもたらす影響を解析する必要性から、ゲノム編集により正常p53遺伝子を有するヒト由来細胞を用いてp53変異細胞の作製を進めた。また、MABGの抗がん作用のノルアドレナリントランスポーター(NET1)依存性を確認するために、NET1発現ベクターを構築とともに、上記細胞におけるNET1の発現検討を進めた。ほぼ、当初の予定通り進んでいる。（３）殺細胞メカニズムの探索：　網羅的解析では、殺細胞メカニズムの探索では、MABG処置した細胞のシングルセル解析試料についてRNAシーケンス解析を実施できた。加えて、２次解析としてバイオインフォマティクスツールを用いて、発現有意遺伝子（DEG）の解析整備ができた。（４）動物実験：　動物実験による解析では、PC12腫瘍細胞株の担がんマウスを用いて、シングルセル化の検討を行った。
Strategy for Future Research Activity	本年度以降は、以下の研究項目を進める。（１）神経芽腫のSK-N-BE(2) 培養細胞の解析：SK-N-BE(2) 培養細胞について、コロニーアッセイ等を用いて放射線抵抗性を調べる。ガンマ線とMABG処置時のデータを比較し、細胞単位での線量不均一性を推定する。（２）p53変異細胞株の作製：ゲノム編集により導入したp53変異細胞株を作製する。作製した細胞株について、p53変異の状況を確認するとともに、ガンマ線照射等により放射線抵抗性を調べる。（３）殺細胞メカニズムの探索：PC12腫瘍細胞、p53野生型SK-N-SH細胞株、及びSK-N-BE(2) 培養細胞について、バルクもしくはシングルセルでのRNAシーケンス解析及び２次解析を実施する。（４）動物実験：PC12腫瘍細、またはSK-N-BE(2) 培養細胞による担がんモデルを作製し、バルクもしくはシングルセルでのRNAシーケンス解析を実施する。