2021 Fiscal Year Annual Research Report
The Study of Molecular Mechanism to Establish Cardiac Progenitor's Identity
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20H03647
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
八代 健太 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60432506)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 心臓中胚葉 / 心臓前駆細胞 / 分化 / シングルセル解析 / エンハンサー解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
胚発生で心臓前駆細胞 (CPCs) が「自己」を確立する分子機構の知見は、先天性心疾患の分子病態の理解と、幹細胞を用いた再生医療に極めて有益である。申請者は独自の研究で、将来の心臓へ寄与する最初期の中胚葉 (心臓中胚葉) がCPCsへと分化していくまでの間の「中間状態にある細胞」が、Gfra2遺伝子と遺伝子X (知財関係で遺伝子名を公表せず) の発現を開始することを発見した。本研究は、CPCsの自己確立過程におけるシグナル、細胞間相互作用、そして分化経路を包括的に理解し、この自己確立の分子機構を解明するための基盤研究を目的とし、分化のステージをGfra2と遺伝子Xの発現開始の前後に分け、（１） CPCsの自己確立の過程におけるマウス胚に対する網羅的シングルセル解析と、（２） Gfra2と遺伝子Xが、CPCsの自己確立過程で発現するために必要十分なエンハンサーの同定を行う研究を展開している。令和２年度はCOVID-19 pandemic下で研究活動が大きく制限を受けたため計画通りに実施できなかった要素項目が多く、研究計画の変更を余儀なくされ、必要な研究費を令和３年度に繰り越した。令和３年度はほぼ計画通りに実施でき、概ね計画通りに進行している。マウス初期胚のシングルセル遺伝子発現解析 (scRNA-seq) のデータ取得を行い、現在はデータの解析中である。また、シングルセルのオープンクロマチン解析 (scATAC-seq) のデータの取得を現在実施している。一方で、エンハンサー解析は遺伝子Xを中心に解析を展開しており、現在、遺伝子Xの発現の十分性を担うゲノム領域の特定を実施しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、心臓中胚葉から心臓前駆細胞 (CPCs)としての自己を確立する過程を支える分子機構を解明するための基盤研究を目的とし、(1) CPCsの自己確立の過程におけるマウス胚に対する網羅的シングルセル解析と、(2) Gfra2と遺伝子Xが、CPCsの自己確立過程で発現するために必要十分なエンハンサーの解析を行う研究を展開している。令和２年度はCOVID-19 pandemic下で研究活動が大きく制限を受けたため計画通りに実施できなかった要素項目が多く、必要な研究費を令和３年度に繰り越して実行した。
(1) 網羅的シングルセル解析：原腸陥入中期（6.5日胚）から初期頭褶期（8.0日胚）までのマウス胚に対するscRNA-seqを実施し、データを得た。パブリックドメインに存在する先行研究データと統合して、シングルセル解析を実施中である。また、同時期のマウス初期胚のシングルセル・オープンクロマチン解析であるscATAC-seqのデータ取得を、初期頭褶期を除く解析標的ステージで取得を完了した。現在は、頭褶期のデータ取得を行なっていて、ほぼ計画通りである。
(2) Gfra2と遺伝子Xのエンハンサー解析：まず、E14tg2a ES細胞株を利用したin vitroエンハンサー探索実験系を、先行研究（Biology Open. 2: 1229-1238, 2013）を参照し立ち上げた。これを用いて、まずは遺伝子Xの上流と遺伝子Xの全exon-intronを含む約16 kbの心臓前駆細胞における転写活性を調べたところ、有為な活性を認めたため、transgenic assayにてマウス胚に行ける活性を確認したところ、極めて弱い活性しか確認できなかった。現在、遺伝子Xの上流・下流を含む全長36 kbの転写活性をES細胞in vitro実験系にて確認中であり、この項目はやや計画に遅れがある。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は、最初期の未分化中胚葉から心臓前駆細胞 (CPCs)としての自己を確立する過程におけるシグナル、細胞間相互作用、そして分化経路を包括的に理解し、この自己確立の分子機構を解明するための基盤研究を目的とし、分化のステージをGfra2と遺伝子Xの発現開始の前後に分け、(1) CPCsの自己確立の過程におけるマウス胚に対する網羅的シングルセル解析と、(2) Gfra2と遺伝子Xが、CPCsの自己確立過程で発現するために必要十分なエンハンサーの同定を行う研究を展開している。
(1) CPCsの自己確立の過程におけるマウス胚に対する網羅的シングルセル解析：すでに解析中のscRNA-seqデータと、現在取得途中のscATAC-seqデータを、”cross-modality integration & label transfer (Cell 177 1888-190, 2019)”により統合し、未分化な中胚葉から心臓前駆細胞へ分化する過程におけるシグナル 経路の変化やクロマチン構造の変化を解析する。この過程で見出される鍵となるシグナル経路や分子に関し、gain-of-functionやloss-of-functionの実験を行うことで、心臓前駆細胞としての自己を確立する過程を支える分子機構の理解に迫りたい。
(2) Gfra2と遺伝子Xが、CPCsの自己確立過程で発現するために必要十分なエンハンサーの同定：まずは遺伝子XのCPCsでの発現に十分なエンハンサー領域を同定し、出来る限り最小の必要十分なエンハンサー 領域へと絞り込む作業をマウスES細胞を用いたin vitroの転写制御解析システムにて実施する。また、Gfra2遺伝子座に対しても同様のエンハンサー領域の探索を実施する。
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