2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a two-step molecular targeted therapy to eliminate gastric cancer stem cells and progenitor cells
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20H03667
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
鈴木 秀和 東海大学, 医学部, 教授 (70255454)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 智典 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (00162454)
津川 仁 東海大学, 医学部, 講師 (30468483)
土居 信英 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (50327673)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 癌幹細胞 / CD44 / CAPZA1 / H. pylori / mucosoid |
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| Outline of Annual Research Achievements |
胃オルガノイド由来幹細胞駆動型上皮細胞モデルMucosoidを用いた解析では、酪酸刺激にて、胃上皮細胞のCAPZA1発現は顕著に亢進し、H. pylori感染により、CAPZA1過剰発現細胞依存的にCagAが蓄積していくことが、Western blotting並びに共焦点レーザー顕微鏡解析による免疫染色法により明らかになった。CagAを蓄積させたCAPZA1の過剰発現細胞は、CD44v9発現の陽性化とともに、LGR5、SALL4及びKLF５発現もそれぞれ陽性化することが確認された。これらの結果から、酪酸刺激下で誘導されたCAPZA1過剰発現細胞へのH. pylori感染によるCagAの装填が、CD44v9陽性がん幹細胞の発生起点になり得ると考えられた。また、前年度に調製したビーズ固定用のSBPタグを融合したCAPZA1-SBP蛋白質をベイトとしてmRNA ディスプレイ法によるヒトVH単一ドメイン抗体ライブラリーの試験管内選択をおこなった結果、CAPZA1に特異的に結合する小型ドメイン抗体を多数取得することに成功した。得られた小型ドメイン抗体を独自の膜透過促進ペプチドおよび核移行配列（NLS）と組み合わせることで、細胞質から核までデリバリーできるかを検討するために、小型ドメイン抗体とペプチドの連結順序を変えた複数のコンストラクトを作成し、機能と局在を調べた結果、抗体の結合活性を維持したまま、核に送達できることが確認できた。また、CD44v9陽性細胞に標的性を示す多糖ナノ粒子による遺伝子のデリバリーシステムの開発を行った。CD44v9陽性細胞に親和性のあるルシフェラーゼ遺伝子pLuc／キトサン／ヒアルロン酸三元複合体では、遺伝子の細胞内導入において核への高い輸送効率が観察されたことから、CD44v9が関与する分子生物学的観点からのメカニズム解析を実施している。さらに、自殺遺伝子pTK含有三元複合体を用いることでCD44v9陽性細胞に対して特異的に細胞増殖抑制効果を得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、CAPZA1過剰発現細胞、およびCD44v9陽性癌幹細胞を標的とした次世代分子標的バイオ医薬を開発し、「癌幹細胞/前駆細胞選択的二段階駆逐型新規癌治療戦略」の確立を目的としている。令和3年度までの研究成果により、胃内共生細菌由来代謝物依存的なCAPZA1過剰発現を介したCD44v9陽性細胞の発生機構が胃オルガノイドを用いたモデルで明確化され、その細胞の標的技術として、mRNAディスプレイ法とキトサン/ヒアルロン酸(HA)で構成したナノ粒子への自殺遺伝子のパッケージング法の開発が順調に進んでいる。今後、これらの標的技術の精度の向上と、標的化の実践の確認のために、胃オルガノイドを応用したmucosoidモデルを用いた機能評価が必要となるが、ここまでの研究開発により標的技術の開発はおおむね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度の成果により、mRNAディスプレイ法を用いたCAPZA1過剰発現細胞の標的技術開発では、CAPZA1にビーズ固定用のSBPタグを融合したCAPZA1-SBP蛋白質を大腸菌で大量発現・精製し、AGS細胞抽出液に含まれるLRP1-ICDとの結合を確認することができたので、今後、CAPZA1-SBPをベイトとしたmRNAディスプレイ法を用いて、CAPZA1に結合するペプチドまたは小型抗体のセレクションを行う。また、調製されたeGFP-LRP1(ICD)-S19-TAT融合蛋白質をAGS細胞に添加すると、膜透過促進ペプチドS19の機能によりLRP1-ICDの細胞内移行が促進されたが、過剰なLRP1-ICDの細胞内移行により細胞死が誘導され、LRP1-ICDの細胞内移行量の調節技術が必要になることが示唆されたため、CAPZA1過剰発現細胞特異的にLRP1-ICDを送達させることを目的に、CAPZA1過剰発現特異的な細胞表層受容体の探索・同定をAGS培養細胞とmucosoidモデルを用いて実施する。さらに、ルシフェラーゼ遺伝子(pLuc)／キトサン／ヒアルロン酸の三元複合体糖ナノ粒子では、CD44v9陽性細胞に特異的な遺伝子の細胞内導入、微小管依存的な核への輸送、および顕著な遺伝子発現活性が得られたため、今後、この糖ナノ粒子内へ自殺遺伝子(pTK)をパッケージングし、CD44v9陽性細胞特異的な抗腫瘍効果をmucosoidモデルにて検討する。
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[Journal Article] Evidence-based clinical practice guidelines for functional dyspepsia 20212022
Author(s)
Miwa H, Suzuki H（6番目）, Tanaka F, Tominaga K, Futagami S, Hojo M, Mihara H, Higuchi K, Kusano M, Arisawa T, Kato M, Joh T, Mochida S, Enomoto N, Shimosegawa T, Koike K
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Journal Title
Journal of Gastroenterology
Volume: 57
Pages: 47～61
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Risk factors and prediction of bleeding after gastric endoscopic submucosal dissection in patients on anti?thrombotic therapy: newly developed bleeding prediction application software, SAMURAI model2022
Author(s)
Hakoda A, Takeuchi T, Kojima Y, Fujiwara Y, Nagami Y, Naito Y, Fukuda S, Koike T, Sugimoto M, Hamada K, Kobara H, Yoshida N, Inaba T, Nagahara A, Koizumi E, Murakami K, Furuta T, Ogasawara N, Isomoto H, Shibagaki K, Kataoka H, Suzuki H, Higuchi K
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Journal Title
Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition
Volume: 70
Pages: 189～196
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] A Questionnaire-Based Survey on the Impact of the COVID-19 Pandemic on Gastrointestinal Endoscopy in Asia2021
Author(s)
Otani K, Watanabe T, Higashimori A, Suzuki H, Kamiya T, Shiotani A, Sugimoto M, Nagahara A, Fukudo S, Motoya S, Yamaguchi S, Zhu Q, Chan Francis K.L., Hahm K, Tablante M.C, Prachayakul V, Abdullah M, Ang T. L, Murakami K,The International Gastrointestinal Consensus Symposium Study Group
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Journal Title
Digestion
Volume: 103
Pages: 7～21
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] A potential pathogenic association between periodontal disease and Crohn’s disease2021
Author(s)
Imai J, Ichikawa H, Kitamoto S, Golob J. L., Kaneko M, Nagata J, Takahashi M, Gillilland M. G., Tanaka R, Nagao-Kitamoto H, Hayashi A, Sugihara K, Bishu S, Tsuda S, Ito H, Kojima S, Karakida K, Matsushima M, Suzuki T, Hozumi K, Watanabe N, Giannobile W. V., Shirai T, Suzuki H, Kamada N
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Journal Title
JCI Insight
Volume: 6
Pages: e148543
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Clue of Diagnosis for Autoimmune Gastritis2021
Author(s)
Nishizawa Toshihiro、Yoshida Shuntaro、Watanabe Hidenobu、Toyoshima Akira、Kataoka Yosuke、Takahashi Yoshiyuki、Kanazawa Takamitsu、Ebinuma Hirotoshi、Suzuki Hidekazu、Koike Kazuhiko、Toyoshima Osamu
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Journal Title
Digestion
Volume: 102
Pages: 903～910
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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