2021 Fiscal Year Annual Research Report

シェルタリン因子による造血微小環境（ニッチ）の機能制御メカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	20H03711
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	新井文用九州大学, 医学研究院, 教授 (90365403)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	細川健太郎九州大学, 医学研究院, 講師 (90569584) 八尾尚幸九州大学, 医学研究院, 助教 (90835282)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	ニッチ / 間葉系幹細胞 / POT1a / シェルタリン因子
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、間葉系幹細胞(MSC)の造血支持能(ニッチ機能)と老化制御におけるシェルタリン因子群の機能を明らかにすることを目的として研究を進めている。これまではPOT1aに着目してMSCの制御における機能解析を進めてきた。 1. MSCの機能維持におけるPOT1aの機能解析：Pot1aコンディショナルノックアウト(KO)マウス(Pot1afl/fl)とNG2-Creマウス(細動脈周囲のMSCを標識)、あるいはLeptin receptor (LepR)-Creマウス(類洞血管周囲のMSCを標識)を交配してMSC特異的Pot1a KOマウスを作製した。NG2-Cre; Pot1afl/flマウスのMSCでは、ミトコンドリア酸化的リン酸が低下し、さらに細胞内に脂肪酸が蓄積していることが分かった。さらに、DNAダメージの蓄積が見られた。一方、LepR-Cre; Pot1afl/flマウスでは、MSC数の減少と代謝とROS産生の亢進、細胞周期の活性化がみられた。 2. ニッチ機能の制御におけるPOT1aの機能：NG2-Cre; Pot1afl/flマウスでは、HSCの機能に大きな変化は見られなかったが、IL-7を産生する骨芽細胞が減少しており、その結果としてBリンパ球が減少していることが分かった。LepR-Cre; Pot1afl/flマウスでは、MSCの機能異常に伴い、細胞周期が静止期にあるHSCの減少、HSCの骨髄再構築能の低下がみられた。 3. POT1aによるMSCの老化制御：POT1aの発現とMSCの老化について検討を進めた。その結果、老齢MSCではPOT1aの発現が低下することが分かった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ニッチ細胞においてシェルタリン因子群がどのような機能を持つのかを明らかにするため、まずはPOT1aに着目して研究を進めてきた。これまでは、MSC特異的Pot1aノックアウトマウス(NG2-Cre; Pot1afl/flとLepR-Cre; Pot1afl/fl)の機能維持とニッチ機能について解析を進めている。 NG2-Cre; Pot1afl/flマウスの解析では、Pot1a KO MSCにおいて酸化的リン酸の低下、細胞内脂肪酸の蓄積、ROS産生とDNA損傷の亢進が見られた。また、骨芽細胞分化に異常が生じ、IL-7を産生する骨芽細胞が減少することで、Bリンパ球の減少が見られた。これらの結果から、骨髄内リンパ球系細胞のニッチにおいてPOT1aが重要な働きをもつことが示唆された。一方、LepR-Cre; Pot1afl/flマウスでは、MSC数の減少と代謝亢進、細胞周期の活性化がみられた。さらにはMSCに異常が生じることにより、間接的にHSCの機能が障害され、静止期維持と骨髄再構築能が低下した。これらのデータから、POT1aはMSC自体の維持に加えて、ニッチ細胞としての機能維持に重要であることが明らかとなった。また、LepRで標識されるMSCはNG2で標識されるMSCよりも多いことから、HSCの維持に及ぼす影響が大きいと考えられた。 MSCの老化に対する作用について、MSCにおけるPOT1の発現が加齢と共に低下していることを見出した。骨髄ニッチの老化とリンパ球分化の低下にPOT1aが関わっており、POT1aを導入することでニッチ側からリンパ球造血をレスキューできる可能性が考えられる。
Strategy for Future Research Activity	MSCの未分化性維持とニッチ機能の制御、老化制御に対するシェルタリン因子群POT1、TPP1、TIN2の機能を解析する。 1. シェルタリン因子群によるMSCの機能制御：①POT1aを導入したMSC、Pot1a KO MSC、および野性型マウスMSCのRNA-Seq解析を行い、Pot1aに依存して発現が変動する遺伝子を抽出する。また、POT1aを導入したMSCについてChIP-Seq解析を行い、POT1aの結合領域を明らかにする。さらに、RNA-SeqとChIP-Seqデータから、MSCにおけるPOT1aの標的分子を同定する。②TIN2はTPP1と結合しない場合ミトコンドリアに移行してROS産生を誘導する。Pot1a KO MSCについて、TIN2の細胞内局在とROS産生レベルを解析する。また、老化MSCについて、TPP1とTIN2の発現レベル、TIN2の細胞内局在とROS産生レベルを明らかにする。 2. ニッチの老化抑制におけるシェルタリン因子の機能：HSCにおいては、POT1aとTPP1を導入することでTIN2のミトコンドリアへの移行を抑制し、ROS産生を抑制できることを見出している。そこで、MSCの培養系にPOT1aとTPP1、あるいはPOT1a標的分子を導入しROS産生レベル、老化関連マーカーの発現を解析する。 3.シェルタリン因子の導入・活性化による老化ニッチ細胞の機能回復：①POT1aとTPP1の細胞膜透過性タンパクを老化MSCに導入し、CFU-Fアッセイ、分化誘導解析を行い、若齢MSCとの比較により自己複製能と分化能の回復を解析する。②POT1aとTPP1を導入した老化MSCとHSCの共培養を行い、HSCの骨髄再構築能が維持できるか検討する。