2020 Fiscal Year Annual Research Report
医工連携によるミニチュアヒト肝臓創成とそのex vivo培養がもたらす革新的医療
| Project/Area Number |
20H03744
|
|---|
| Research Institution | Kumamoto University |
|---|
Principal Investigator |
山下 洋市 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 准教授 (00404070)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井嶋 博之 九州大学, 工学研究院, 教授 (10274515)
相島 慎一 佐賀大学, 医学部, 教授 (70346774)
米満 吉和 九州大学, 薬学研究院, 教授 (40315065)
馬場 秀夫 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (20240905)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | ミニチュアヒト肝臓 / 脱細胞鋳型肝臓 / ex vivo還流培養 / 類洞構造 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
① ミニチュア肝臓内での肝細胞の類洞様配列の再現：予めHUVECで門脈を内皮化し（部分的にしかできていない）、初代培養肝細胞の播種経路を肝動脈に変更して播種して4日間ex vivo還流培養を実現する事で、ミニチュア肝臓（再細胞化脱細胞鋳型肝臓）内に肝特異構造である「類洞様配列」を再現できた。初代培養肝細胞を経門脈で播種した場合は、培養2日目にはアルブミン分泌能を喪失するのに対して、経肝動脈で播種した場合は、高いアルブミン分泌を維持できた（約7 pg/cell/day）。
② ミニチュア肝臓内での管腔（脈管？）様構造の再現：播種細胞を初代培養肝細胞（2x107 cells）＋HUVEC（1.4x107 cells）＋脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）（4x106 cells）の3種類に増やして、①同様に門脈の内皮化→経肝動脈播種→4日間のex vivo還流培養を行った所、肝細胞の類洞様配列に加えて、組織内に径15μm程度の管腔（脈管？）様構造が確認できた。この管腔様構造と門脈が連結できれば、より高い肝特異構造を実現できると考えている。
③ オルガノイド播種による高い肝特異機能の発現：初代培養肝細胞1.28x105 cellsを予めチップで培養してオルガノイド（粒径100μmのスフェロイド）を形成し、このオルガノイドを①同様に播種してex vivo還流培養を行った所、初代培養肝細胞の単一細胞播種の場合より高いアルブミン分泌を示した（12 vs. 23 pg/cell/day）。
④ オルガノイドへの酸素供給を増加させるための工夫：②と同じく、初代培養肝細胞＋HUVEC＋ADSCをチップに播種して、オルガノイド（粒径100μmのスフェロイド）を作製した。このオルガノイドを蛍光顕微鏡で観察すると、オルガノイドの中央部にHUVECが集まって分布していた。酸素供給の最も悪いオルガノイドの中央部に脈管を創る事ができる可能性があると考えている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
HUVECにより門脈の部分内皮化を実現し、通常の門脈経由でなく、肝動脈経由で肝細胞を播種し再細胞化する事が最も肝特異機能を引き出すことを明らかにした。Ex vivo還流回路の酸素供給向上の工夫や、再細胞化肝臓の被膜補強の工夫により、4日間という長期還流培養に成功し、肝特異構造で有る『類洞』を模した肝細胞配列を再現できた。胆管細胞の初代培養に難渋しているものの、脂肪細胞由来間葉性幹細胞を代替として初代培養肝細胞とHUVECと混合播種する事で、再細胞化肝臓内に脈管を模した管腔様構造の構築に成功した。
一方で、単一細胞ではなく、予め長径100μm程度の小オルガノイド（スフェロイド）を播作製して肝動脈経由で播種する事で更に高い肝特異機能を引き出せる可能性があること、初代培養肝細胞＋脂肪細胞由来間葉性幹細胞＋HUVECでオルガノイドを作製すると中心部にHUVECが集族する事を明らかにした。即ち、3種細胞を混合して作製したオルガノイドを播種して再細胞化する事で、類洞様配列および組織内脈管ネットワークを再現した高い肝特異機能を持つミニチュア肝臓作製の可能性があると考えている。
まだ機能発現は不充分なものの、初代培養肝細胞の不死化とヒトiPS細胞からの肝細胞様細胞への分化誘導に成功している。機能性ゲル基材を最適化してオルガノイド作製すれば、更に高い肝特異機能を発現できる再細胞化肝臓を作製できる可能性がある。
ミニチュア肝臓の細胞源とex vivo長期還流培養に一定の目処がたったため、現在までの進捗状況は、『概ね順調に進展している』と考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1. ヒト由来機能性肝細胞・胆管細胞の樹立
ヒト初代培養系とヒトiPS細胞系の両面から増殖能を持つヒト由来機能性細胞（肝細胞・胆管細胞）を得る。また、胆嚢摘出または胆管切除を行った症例の胆嚢や胆管を酵素処理する事で、ヒト初代培養胆管細胞を得る。初代培養肝細胞・胆管細胞ともin vitroでの増殖能がないため、初代培養細胞にレンチウイルスを用いて、テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子（hTERT）やSV-40を導入し不死化させて増殖能を獲得させる。また、ヒトiPS細胞から肝細胞または胆管細胞へ分化誘導して、高機能ヒト由来肝細胞・胆管細胞を得る。
2. 機能性ゲル基材の最適化
操作変数を強度、分解速度、ヘパリン導入密度（増殖因子固定化密度、抗血栓性）として、ヘパリン導入ゼラチンゲル基材の最適化を図る。この機能性ゲル基材で包埋したヒト由来機能性細胞をディスク状の脱細胞化肝臓に播種して免疫抑制ラットの腹腔内に移植し、血管新生、肝組織構築、肝特異機能発現（PAS染色、アルブミン染色など）を病理組織学的に評価する。
3. ex-vivo還流培養による肝特異構造（類洞構造や脈管ネットワーク構築）の再現
極小型人工肺モジュールを配してMPCポリマーで処理した ex vivo 培養回路を構築し、ヘモグロビン包埋リポソームやアルブミンーヘム複合体など人工血液を利用して酸素供給を上げ、７日間の長期還流培養を実現する。肝細胞・胆管細胞（またはADSC）・HUVECを上記機能性ゲル基材に混ぜてスフェロイド培養して、内部に脈管構造を持つオルガノイドを作製する。そのオルガノイドを肝動脈経由で播種して、７日間ex vivo還流培養して、ミニチュアヒト肝臓の組織構築をH＆E染色で経時的に評価する。肝特有の『類洞・肝小葉構築』と『脈管ネットワークの』が再現できるかが鍵と考えている。また、アルブミン分泌能、アンモニア代謝能、そして胆汁排泄を検討して、ミニチュアヒト肝臓の肝特異機能を評価する。
|
