2020 Fiscal Year Annual Research Report

ヒト口腔内間葉ミューズ細胞から分化誘導した心臓原基を用いた新規再生医療法の開発

Research Project

Project/Area Number	20H03761
Research Institution	University of Tsukuba
Principal Investigator	鈴木保之筑波大学, 医学医療系, 教授 (60344595)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	石川博筑波大学, 医学医療系, 研究員 (30089784) 丸島愛樹筑波大学, 医学医療系, 講師 (40722525) 松丸祐司筑波大学, 医学医療系, 教授 (70323300) 豊村順子筑波大学, 医学医療系, 研究員 (80645630) 松村明筑波大学, 医学医療系, 客員教授 (90241819) 大山晃弘筑波大学, 医学医療系, 研究員 (90538232) 渡邊美穂大阪市立大学, 大学院医学研究科, 特任助教 (20845317)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	歯髄幹細胞 / 胚様体 / 胚子成長因子（EmbGF） / 胚子様構造体 / 心臓原基
Outline of Annual Research Achievements	虚血性心疾患、心筋症、心臓弁膜症を再生医療で治療することを目的に、心筋壁を構成する細胞や心弁膜を構成する細胞をone set得る方法を開発する。そこで腫瘍形成のない、また倫理的問題の少ない体性幹細胞（組織幹細胞）のうち、万能細胞の存在が示唆されている歯髄を再生医療のための細胞源とした。まず、ヒト抜去歯をヨード液で消毒後、ディスクカッターで縦断し歯髄を採取した。採取した歯髄を細切し、out growth法で歯髄初代培養細胞を得た。次に歯髄初代培養細胞から薄播き法で歯髄幹細胞を得た。幹細胞であることをNanog, Oct3/4, Sox2　をマーカーとして評価した。まずこの幹細胞を天蓋培養し胚様体を作製した。この胚様体をローズのチャンバーに入れ、我々が新たに開発したEmbGFを添加した培養液で約4週間還流培養し胚子様構造体を生育させた。胚子様構造体内には各種の器官・臓器の原基が存在していたが、それらの存在部位はまちまちであった。しかし心原基は拍動しているため実態顕微鏡下での採取は容易であった。採取した心原基から実態顕微鏡下に心筋層、心臓中隔、心弁膜をそれぞれ別々に採取した。それぞれの組織を消化酵素液に浸漬し37℃で加温後、細胞をピペティングで解離した。心筋層からは心筋細胞、刺激伝導系細胞（プルキンユ細胞）、血管内皮細胞、心内膜上皮細胞を分離出来た。心筋細胞はシート状に増殖し、シート形成後も自動拍動を繰り返した。また心筋シートは消化酵素液で加温すれば容易に単離細胞となった。プルキンユ細胞はangularな細胞で互いに癒合して容易に細胞索を形成した。血管内皮細胞はマトリゲル上で有窓の血管網を作製した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今まで歯髄幹細胞を天蓋培養すると、胚様体形成率は約２５％であった。培養液量と細胞数を調整して現在形成率の向上を図っている。新たに作製したEmbGFを用いることにより胚様体からの胚子様構造体の作製率が５０％と飛躍的に向上した（特許準備中）。胚様体がローズのチャンバー壁に接着してしまうと平板上に発育し体腔を有する胚子様構造体に発育しない。また体腔がないと各種の器官・臓器の原基の発育も悪くなるため、チャンバーの壁に胚様体を接着させないため、あらかじめチャンバー内をポリエチレングリコールでコーティングした。また還流液の流速を拝様体や、胚子様構造体の大きさに合わせて適宜調節した。4週間の還流培養では、拍動する心臓原基は１心房1心室であったため、培養期間を8週まで伸ばしたところ、2心房2心室の心臓原基を得ることができた。しかし心臓原基の大きさや心房・心室の大きさはさまざまであった。また心房と心室の間には大きな弁膜を確認することができた。しかし心房心室とも中隔壁には穴が開いていた。心筋壁から分離した心筋細胞は増殖しシートを形成した後も、その拍動は約1か月以上持続した。シート状に増殖した心筋細胞を消化酵素液で加温後、ピペティングで細胞を解離しDMSOフリーのクライオスカーレス液を用いて液体窒素液中で凍結保存した。解凍後も自動収縮を繰り返す心筋細胞として増殖させることができた。心内膜上皮は敷石上に増殖しシートを形成する。ZO-1抗体による免疫染色で、シートは網目状に染色されたことから細胞間に閉鎖帯の存在が示唆された。刺激伝導系細胞はangularな細胞で多量のグリコーゲンを内在し、シャーレ内で容易に細胞索を形成する。神経細胞維持培養液で増殖させることが可能であった。自動収縮は観察されなかった。
Strategy for Future Research Activity	１）心筋梗塞モデル動物を作製する。うまくできないときは購入することを考える。２）心臓原基から実態顕微鏡下に心筋壁を分離し、心筋梗塞モデル動物に移植する。また、心筋細胞を直接心筋梗塞巣に移植する方法を検討する。移植後、心エコーや冠動脈撮影で評価し、最終的に組織病理標本を作製し評価を行う。３）刺激伝導系細胞はシャーレ中で容易に細胞索を形成するので、PDMS板状に任意の長さと太さの溝を作製し、刺激伝導細胞索を作製し電気生理的に評価する。４）心筋細胞を接着させたアテロコラーゲンビーズ（心筋細胞ビーズ）と血管内皮細胞を接着させた血管内皮細胞ビーズを旋回培養法で別々に作製し、PDMSプレートに任意の大きさのwellを作製してその中に両者を混合して入れ、還流培養して、任意の大きさと形の毛細血管内在心筋細胞オルガノイドを作製し、梗塞巣に移植し評価する。我々はすでに血管内在組織の作製に関する特許を取得している（特開2019-154331）。