2020 Fiscal Year Annual Research Report

中枢神経系悪性リンパ腫の腫瘍内多様性と微小環境解析による病態発生の解明と治療開発

Research Project

Project/Area Number	20H03795
Research Institution	Kyorin University
Principal Investigator	永根基雄杏林大学, 医学部, 教授 (60327468)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	片岡圭亮国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (90631383) 市村幸一国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (40231146) 立石健祐横浜市立大学, 医学部, 助教 (00512055) 富山新太防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 病院脳神経外科, 講師 (40385810)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	中枢神経系悪性リンパ腫 / シングルセル解析 / 腫瘍内多様性 / 微小環境解析
Outline of Annual Research Achievements	我々はこれまでに中枢神経系悪性リンパ腫(PCNSL)の包括的遺伝子解析を施行し、全身性のびまん性大型B細胞リンパ腫(DLBCL)と異なる特徴的遺伝子異常パターンを報告した。しかし、PCNSLと全身性DLBCLの病態の類似性および相違性については未だに明らかでない点が多い。そこで、本研究では特にPCNSLにおける遺伝子異常を起点とした腫瘍内の多様性および免疫微小環境の多様性を解明することを目的とした。 2020年度は、実際のPCNSL臨床検体を用いたシングルセル解析を行うための基盤、すなわち、新規患者での生検術後に細胞の生存率を保ったまま、解析施設に検体移送を行い、組織からDNA/RNAを抽出し、残検体から細胞浮遊液を作製するという標本処理を行うロジスティックスを確立した。条件検討を重ね、シングルセル解析に耐えうる細胞数および生存率が得られる最適条件が得られ、そのロジスティックスに従って収集した検体を用いてフローサイトメトリー解析を行ったところ、腫瘍細胞に加えて、多様な免疫細胞の浸潤を確認することができ、当初の研究計画が十分に遂行可能であることを確認した。本年度は13症例のPCNSL臨床検体を収集し、全症例について、腫瘍組織からのDNA/RNA、末梢血からのDNA抽出を完了している。このうちの9検体については、130種類の表面マーカー解析、mRNAトランスクリプトーム解析、TCR/BCRレパトア解析を同一のシングルセルから取得可能なマルチオミクスシングルセル解析技術を用いたライブラリー調整を行い、次世代シーケンサーを用いて、これらのデータを既に取得済みである。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 2020年度の達成目標は、検体収集から標本処理までのロジスティックスの確立、およびフローサイトメトリー解析による実験系の最適化であったが、この目標は十分に達成された。検体収集についても、研究計画全体で20-30症例を予定しているが、研究開始初年度に13症例が既に登録、検体取集が完了している。収集した全症例で、腫瘍組織DNA/RNAと末梢血DNAの抽出が完了しており、9検体については、翌年度に計画していたシングルセル解析を開始し、既にデータも取得することができており、当初の計画以上に進展している。
Strategy for Future Research Activity	検体の収集を引き続き継続する。現在までに計画以上のペースで収集が進められているが、不十分となった場合には共同研究施設からの検体収集も検討する。集積した検体については、順次シングルセルデータを取得し、PCNSLの腫瘍内、微小環境における多様性について解析を進める。また、腫瘍組織および末梢血から抽出したDNAを用いた網羅的遺伝子変異解析を進め、シングルセルデータとの統合解析を行う。また、2021年度には、画一的な治療を施行したPCNSL患者の生検標本からDNAを抽出し、NGSを用いたリンパ腫関連遺伝子パネルにて変異解析を行うことで、未だ予後に関する分子マーカーが明らかではないPCNSLの予後因子解析も併せて行う予定である。