CRISPRスクリーニングによる緑内障感受性遺伝子の同定

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H03838
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 中澤 徹 東北大学, 医学系研究科, 教授 (30361075)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 航 東北大学, 大学病院, 助教 (20646442) ; 佐藤 孝太 東北大学, 医学系研究科, 助教 (50732327)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 緑内障

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、緑内障に対し神経保護治療のターゲットとなる網膜神経節細胞の脆弱性に寄与する遺伝子変異とそのメカニズムを同定することを目的とした。前年度に引き続き、緑内障病態との関連が報告されているストレス（酸化ストレス、興奮毒性、炎症、低栄養、低酸素）の負荷条件を、マウス海馬由来神経細胞株HT22ならびにヒト神経芽細胞株SH-SY5Y細胞を用いて検討した。その結果、酸化ストレスについてはbuthionine sulfoximine（グルタチオン合成阻害剤）、炎症についてはTNF, 低栄養については低FBS、低酸素については低グルコース/低酸素刺激による細胞生存率の低下とアポトーシス誘導の至適濃度ならびにタイムコースを、アラマーブルーによる生存率評価ならびにタイムラプス顕微鏡撮影によるCaspase3/7とAnnexinVの蛍光プローブ測定により決定することができた。また、上記ストレス刺激に対応する動物を用いた病態モデル（静水圧負荷による虚血再灌流、 N-methyl-D-aspartate硝子体投与、TNF硝子体内投与、視神経軸索切断）を作製し、網膜神経節細胞の障害誘導を確認した。細胞培養ならびに動物モデルが確立したため、今後の実験で実施予定であるCRISPRスクリーニングにより同定された網膜神経節細胞の脆弱性に寄与する候補遺伝子が抽出されたのち、本疾患モデルを用いて候補遺伝子変異による緑内障病態のメカニズム解明に使用する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

CRISPRスクリーニングに使用するレンチウイルスライブラリーが受注生産であり、想定以上にスクリーニングライブラリーの納期に時間がかかったため。

Strategy for Future Research Activity

Cas9安定発現細胞株の樹立ならびにCRISPRライブラリー用レンチウイルスベクターを作製し、緑内障ゲノムワイド関連解析により見出された緑内障関連遺伝子の神経脆弱性に寄与する遺伝子群をCRISPRスクリーニングにより同定する。