Analysis of metastasis and growth of melanoma cells under irradiation of specific light exposure with Gq mutation

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H03849
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 橋川 和信 神戸大学, 医学部附属病院, 医学研究員 (90403237)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 榊原 晶子 神戸大学, 医学部附属病院, 助教 (00569866) ; 野村 正 神戸大学, 医学部附属病院, 准教授 (30529566) ; 高須 啓之 山口大学, 医学部附属病院, 准教授 (40566022) ; 榊原 俊介 神戸大学, 医学部附属病院, 特命講師 (50444592) ; 寺師 浩人 神戸大学, 医学部附属病院, 教授 (80217421)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: メラノーマ / メラノプシン / Gq

Outline of Annual Research Achievements

BRAF変異のある細胞株(G361)および変異のない細胞株(Mewo)を対象に研究を開始した。まず、これらの細胞を培養したのち、青色光に感受性のある光受容タンパク質であるメラノプシンの発現を確認した。細胞をホモジェナイズし、得られた細胞懸濁液に対してウェスタンブロっティングを行い、いずれの細胞株においてもタンパク質レベルでメラノプシンが発現していることを確認した。次にtotal RNAを抽出し、RTーPCR法によりmRNAレベルにおいてメラノプシンがいずれの細胞株においても発現していることを確認した。
次にいずれの細胞株においてもGqタンパク質（つまり、Gnaq、G11の２種類）が発現しているのか、を確認するためにGqに対するPCRプライマーを設計し、RTーPCRを行ったところ、いずれの細胞株においてもGnaq及びG11の発現が確認された。この時点でのPCRは断片に対しての遺伝子の増幅であり、遺伝子の変異が生じているのかについては示すことができない。そこで、全長クローニングを行うために新たにプライマーを設計した。プライマー部位は全長mRNAを参考に翻訳部位の外側に設計した。Maxwell RSC核酸精製システムを用いて培養したメラノーマ細胞株から自動的にtotal RNAを抽出した。抽出された遺伝子量は十分に回収できており、これに対して再度RTーPCRを行ったが、目的とする長さのバンドが得られなかったため、現在、諸条件を設定し直しながら全長クローニングを試みている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

新型コロナウイルス感染症による影響で非常事態宣言下、研究活動が一時停止となった。また、その影響により雇用予定であった技術補佐員の確保ができず、研究を遂行する上で支障があったため。

Strategy for Future Research Activity

まず、それぞれの細胞株におけるGq遺伝子の全長クローニングを行い、これらの遺伝子配列を解析することで、Q209L変異を生じているのか、についての確認をおこなう。
変異が認められなかった場合は、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムにより相同性組み替えを行う。また同時に、これらの細胞株においてメラノプシンのノックアウト株を作成する。