2020 Fiscal Year Annual Research Report
Identification of regulators of bone regeneration using multiple modes of CRISPR-Cas9 genetic screens
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20H03872
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| Research Institution | Matsumoto Dental University |
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Principal Investigator |
中道 裕子 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 講師 (20350829)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宇田川 信之 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70245801)
堀部 寛治 松本歯科大学, 歯学部, 助教 (70733509)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | Wnt / ビタミンD / 骨再生制御因子 / ゲノム編集スクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ビタミンDシグナルの過剰に起因する骨形成不全および腎疾患における骨芽細胞内のVDRの役割を明らかにした（Endocrinology 161(11):bqaa178, 2020）。in vivo骨芽細胞が活性型ビタミンＤ応答性に放出する骨再生抑制因子および動脈石灰化促進因子の同定のための実験を行った。その結果、ビタミンDの過剰とWntシグナル伝達破綻の関連が示唆された。そこで、 Wntシグナルの正の調節因子（骨再生促進因子）および負の調節因子の同定のためのCrispr-A, Crispr-KOライブラリーの調製を行った。遺伝子発現オンシステムCrispr-A と遺伝子発現オフシステムCrispr-KO により発現上昇または抑制した各遺伝子機能を、代表者が開発したWntシグナル活性依存性細胞死回避レポーターシステムを用いて評価する系を構築した。具体的には、Crispr-構成要素とWntシグナル活性レポーターBAR (beta-catenin-activated reporter)共発現モノクローナル骨芽細胞前駆細胞を樹立した。また、Wnt3aを6時間処理したマウス骨髄間葉細胞株ST2細胞をリン酸化タンパク質量分析に供し、Wntシグナルによるタンパク質リン酸化の変化を解析した。5つのBiological replicateにおいて共通にシグナル強度が上昇するリン酸化ペプチドを得ることが出来た。そして、骨髄間葉細胞の骨芽細胞分化および脂肪細胞分化過程の双方において、これらのリン酸化ペプチドのmRNA発現変化を解析した。今後は、リン酸化部位変異タンパクをST2細胞などの未分化間葉系細胞に過剰発現させることで、同定したリン酸化の生物学的意義を解明する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ビタミンDシグナルの過剰に起因する骨形成不全および腎疾患における骨芽細胞内のVDRの役割を明らかにした。特に骨吸収の異常亢進および骨形成の亢進に伴う、血清カルシウム値の上昇、血清FGF23値の数千倍レベルの上昇を見出し、これらの作用において骨芽細胞のVDRが不可欠であることを明らかにした。また、血清カルシウム値の上昇に、FGF23による腎におけるカルシウム再吸収の亢進が重要であることを明らかにした。これらの発見を、Mori et al. Endocrinology 161(11):bqaa178, 2020 に報告した。この知見をもとに、ビタミンDシグナルの破綻による骨形成抑制機構を解析中である。 また、Wntシグナル下流にある骨形成調節因子を、リン酸化タンパクLC-MS/MSによるリン酸化プロテオーム解析にて探索した。Five biological replicates前骨芽細胞を用いた実験により、候補骨形成促進因子を見出した。現在、候補遺伝子の発現および機能解析を進行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ビタミンDシグナルの伝達異常に起因する骨メタボリック症候群における骨芽細胞内のVDRの役割を明らかにする。特に動脈石灰化や脂質および糖代謝、骨形成・骨吸収の調節における骨芽細胞内のVDRの役割に着目して、骨芽細胞特異的VDR欠損マウスを用いて研究を行う。具体的には、骨芽細胞が存在する骨のみならず、異常が生じた遠隔臓器のmRNA発現プロファイルをRNAシーケンシングにより作成する。
また、Wntシグナル受容体14種類の中で、成体における骨形成と脂質代謝の双方において非常に重要な分子を見出した。本研究室で作製した当該分子遺伝子欠損マウスは、骨形成の顕著な低下を示すとともにメタボリック症候群を発症した。骨芽細胞特異的当該遺伝子欠損マウスと対照マウスの骨組織からRNAを抽出し、RNAシーケンシングにより両マウスのmRNA発現プロファイルを作成する。発現差異のあった分泌性因子については、骨髄間葉細胞で過剰発現したり、ノックアウトすることで、機能解析を行う。
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