2021 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of mechanism of prooxidant effect on cancer cells by polyphenols
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20H03926
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
細川 敏幸 北海道大学, 高等教育推進機構, 教授 (00157025)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
斎藤 健 北海道大学, 保健科学研究院, 客員研究員 (40153811)
佐藤 伸 青森県立保健大学, 健康科学部, 教授 (40310099)
向井 友花 神奈川県立保健福祉大学, 保健福祉学部, 教授 (60331211)
藏崎 正明 北海道大学, 地球環境科学研究院, 客員研究員 (80161727)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ポリフェノール / 抗酸化作用 / プロオキシダント作用 / ガン細胞 / アポトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、ポリフェノール類が未分化細胞であるガン細胞等で遺伝子に定められた細胞死・アポトーシスを誘導することが報告されている。通常、抗アポトーシス作用を示すポリフェノールが、何故ガン細胞でアポトーシスを誘導するのかに関する詳細な機構は未だ不明である。本研究では、ポリフェノール類による抗ガン作用がどのような機構によって起こるのかを正常細胞と比較することで解明することを目的とした。本研究の達成により、植物成分であるポリフェノール類により負担の少ない抗ガン剤の開発が期待される。
上記の目的のもと、ポリフェノールとしてフラボノイド系からエピガロカテキンガレート、スチルベン系からレスベラトロールを選択し、ヒト肝細胞癌由来細胞であるHepG2、ヒト結腸癌由来細胞Caco-2細胞に様々な濃度で曝露すると濃度依存的に細胞死が増加し、細胞毒性の指標である培地中乳酸脱水素酵素量も有意に増加した。細胞内酸化状態の指標である還元型グルタチオンの量はポリフェノール投与量増加と共に有意に減少し、ポリフェノール曝露細胞より抽出されたDNAはラダー状を示し、p53および活性型キャスペース3および7の量が有意に増加していた。さらにAnnexin Vを用いたフローサイトメトリー、mTor、活性型(リン酸化）mTor、Akt、活性型Akt、NFκB、活性型Erk量、FOXO、XIAPおよびSIRT1測定のためウェスタンブロット法などを行った。その結果、0.01から0.05 mMのエピガロカテキンガレートあるいはレスベラトロールの曝露でHepG2細胞およびCaco-2細胞にまずオートファジーを誘導し、その後にアポトーシスを誘導していることが確認できた。
一方、正常細胞としてヒト正常肝細胞であるHUCPG細胞にレスベラトロールを曝露し、細胞死に至る機構をウェスタンブロット法などにより現在解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年より流行したコロナ禍により、5人の研究者が実際に会って情報を共有したり、学会などで成果を発表するなどの機会には恵まれなかったが、メール、電話あるいはリモートにより相互の連絡は密に行うようにしていた。正常細胞に関する実験はやや遅れているが、すでに生残率などの実験を行い、細胞死経路に至るウェスタンブロットなどを行う細胞サンプルも十分にストックされ、一部ウェスタンブロットの解析は行われている。
現在までの結果は、生残率に関しては期待されるほどの差が認められなかったが、オートファジーやアポトーシス関連因子では期待に近い差が確認できそうである。
正常細胞に比べガン細胞における実験は本年度ですべてのデータの採取を終えることができた。ヒト肝細胞癌由来細胞であるHepG2、ヒト結腸癌由来細胞Caco-2細胞にレスベラトロールあるいはエピガロカテキンガレートを様々な濃度で曝露すると細胞にまずオートファジーを誘導し、その後にアポトーシスを誘導していることがオートファジーおよびアポトーシスの経路に存在する20に及ぶ因子、形態学的変化およびANNEXIN Vを用いたフローサイトメトリーなどで確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの成果として、ヒト肝ガン細胞HepG2およびヒト大腸ガン細胞Caco-2にポリフェノール類であるレスベラトロールあるいはエピガロカテキンガレートを様々な濃度で投与すると、0.01から0.05 mMで細胞内に活性酸素種が増加することにより細胞死が誘導されることが分かった。このことはポリフェノール類がガン細胞に一般的に認識されている抗酸化作用ではなくプロオキシダント作用を及ぼしていると考えられる。また、ガン細胞にまずオートファジー経路の因子が活性化され、最終的にアポトーシスが誘導されていることが明らかになった。しかし、ヒトの正常肝細胞HUCPG細胞にレスベラトロールを投与した場合、細胞死を誘導するレスベラトロール濃度が肝ガン細胞との間に明瞭な差が認められなかった。それらの知見を基に本年度は以下の実験を行う。
①ヒトの肝正常細胞にレスベラトロールにより誘導された細胞死の機構をウェスタンブロッティング法およびリアルタイムPCR法等を用いて明らかにし、ガン細胞との違いを明確にする。②ヒトの正常肝細胞にレスベラトロール以外のポリフェノール、エピガロカテキンガレートを投与し、どの濃度で細胞死を起こすかを検討し、ヒト肝ガン細胞での結果と比較する。③ヒトの正常大腸細胞を用いてレスベラトロールあるいはエピガロカテキンガレートを投与し、どの濃度で細胞死を起こすかを検討し、ヒト大腸ガン細胞での結果と比較する。④②および③の細胞サンプルを用いてポリフェノール類により誘導された細胞死の機構をウェスタンブロッティング法およびリアルタイムPCR法等を用いて明らかにし、ガン細胞との違いを明確にする。⑤①から③の細胞サンプルを用いて、活性酸素種量の測定。およびHoechst染色等を用いてアポトーシスを誘導した細胞の割合の測定を行う。⑥以上３年間の結果を取りまとめ、報告書を作成し、論文にまとめる。
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