2020 Fiscal Year Annual Research Report
Identification and function analysis of sulfane sulfur-binding proteins responsible for detoxification of environmental electrophiles
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20H04340
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
新開 泰弘 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (10454240)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 環境中親電子物質 / サルフェン硫黄 / メタロチオネイン / 毒性防御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内において、サルフェン硫黄はタンパク質の翻訳時の段階で入り込んでいることが明らかとなってきた。しかしながら、具体的にどのようなタンパク質にサルフェン硫黄が多く結合しているのかは明らかになっていない。そこで本年度は、サルフェン硫黄が結合しているタンパク質（sulfane sulfur binding protein, SSBP）の単離・精製とその同定を行った。マウスの脳を細胞分画してサイトソル画分を調製し、低分子を取り除いて高分子画分を得た。得られた画分を陰イオン交換カラムで分離し、各フラクションに親電子プローブであるβ-(4-hydroxyphenyl)-ethyl iodoacetami de(HPE-IAM)を反応させて、タンパク質に結合したサルフェン硫黄をBis-S-HPE-AM誘導体とし、安定同位体希釈法を用いたLC-MS法により定量してサルフェン硫黄が結合しているタンパク質を調べた。その結果、陰イオン交換カラムへの親和性の有無に関わらず、タンパク質の溶出画分に多くのSSBPが存在することが分かった。この中でSSBPを比較的多く有する画分をSephacryl S-100カラムおよびBlue Sepharoseカラムで更に単離・精最終的に得られた純製を行い、SDS-PAGE上で16 kDaを有するSSBPを単一バンドとして得ることに成功した。得られたタンパク質をLC-MSで分析・同定したところ、当該タンパク質はメタロチオネイン-3（MT3）だった。これはMT3の抗体を用いたウエスタンブロットでも確認できた。タンパク質におけるサルフェン硫黄の機能性を詳細に検討するため、大腸菌の高発現系を用いてヒトリコンビナントMT分子種（MT1, MT2, MT3）を精製し、いずれのMT分子種にも確かにサルフェン硫黄が結合していることをLC-MS法やラマン分光法で明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
カドミウムやメチル水銀などの親電子物質は環境中にユビキタスに存在し、ヒトの健康を障害するリスク因子であることが理解されており、それらに対する生体防御機構の理解は重要な課題である。我々のグループは、チオール基に追加でサルフェン硫黄が付加したパースルフィドなどの活性イオウ分子が環境中親電子物質を捕獲し、不活性なイオウ付加体に変換することを世界に先駆けて報告している。本課題は、申請者が最近確立した手法を用いて、生体内においてサルフェン硫黄が結合しているタンパク質を単離・同定し、当該タンパク質の環境中親電子物質に対する防御的役割を明らかにすることを目的としている。その中でも本年度は、サルフェン硫黄が結合しているタンパク質（SSBP）を同定することを主たる目的としており、マウス脳よりSSBPの１つとしてMT3を同定できた。本結果を裏付けるために、大腸菌の高発現系にてMT分子種（MT1, MT2, MT3）をそれぞれ調製し、いずれのMT分子種にもサルフェン硫黄が確かに結合していること解析して明らかにした。従って本年度の当初の目的は達成されており、順調な進捗と言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
メチル水銀のような親電子物質は細胞内タンパク質のチオール基を介して共有結合することで、それらの機能障害や細胞毒性を惹起する。一方、メチル水銀は生体内で活性イオウ分子に捕獲・不活性化され、毒性の低いイオウ付加体であるビスメチル水銀サルファイドに変換される。しかしながら、SSBPの存在とその毒性学的意義との関わり合いは不明である。昨年度までの研究成果により、マウス脳のサイトソル画分におけるSSBPの１つとして、我々はMT3を同定した。今後はMT分子種（特にMT3タンパク質）に焦点を当て、親電子ストレスに対する防御的役割やタンパク質がサルフェン硫黄によって修飾を受ける機能性の変化について詳しく解析する。更に、MT3は抗酸化性を有することは既に報告されているが、酸化ストレスに対してMT3結合性のサルフェン硫黄が果たす役割についても明らかにする。また、培養細胞系において、MT3の発現をノックダウンすることによって、親電子ストレスや酸化ストレスに対する感受性が変化するかを検証する。更に、MTは生体内では亜鉛結合タンパク質であることから、亜鉛の保持・遊離とサルフェン硫黄との関係性についても詳しく解析していく予定である。
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Research Products
(6 results)
