2020 Fiscal Year Annual Research Report

iPS細胞由来ニューロンの単一細胞解析を可能とするデバイス構築

Research Project

Project/Area Number	20H04506
Research Institution	Kyushu Institute of Technology
Principal Investigator	安田隆九州工業大学, 大学院生命体工学研究科, 教授 (80270883)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	廣瀬伸一福岡大学, 医学部, 教授 (60248515) 桂林秀太郎福岡大学, 薬学部, 准教授 (50435145)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	マイクロデバイス / 微小孔 / 微小電極 / ニューロン / アストロサイト / 共培養 / 単一細胞解析 / 細胞外電位計測
Outline of Annual Research Achievements	微小孔アレイを有する窒化シリコン（SiN）膜上で単一ニューロンを培養する技術を構築するために、以下の実験を行った。シリコン製のリング構造で支持した直径6.5mm、膜厚1μmのSiN膜に、直径3μmの微小孔を多数形成した。この膜表面に、直径300μmの貫通孔を8×8個形成したPDMS製シートを貼り付けることで、単一ニューロン培養用の円形ウェルをアレイ状に形成した。膜裏面に多数のマウス大脳皮質アストロサイトを播種した後に、膜表面に少数のマウス海馬ニューロンを播種して、SiN多孔膜を挟んだ共培養を行った。単一ニューロンのみが接着しているウェルを選択し、シナプスに局在するタンパク質VGLUT1を蛍光染色することで、多数のシナプス形成を確認した。次に、微小孔アレイを有するSiN膜上でiPS細胞からニューロンを分化誘導する技術を構築するために、以下の実験を行った。ヒトiPS細胞201B7にTet-on遺伝子発現誘導系プラスミドを導入し、転写因子Neurogenin2を発現させることで、グルタミン酸作動性ニューロンへ分化させた。ニューロンが特異的に有するβIIIチューブリンを蛍光染色することで、分化誘導の成功を確認した。さらに、微小孔アレイを有するSiN膜上の微小電極を用いてニューロンの細胞外電位を計測する技術を構築するために、以下の実験を行った。SiN膜の中央部に一辺50μmの白金黒製の微小電極を8×8個のアレイ状に形成した。また、SiN膜に直径5μmの多数の微小孔を形成した。膜裏面にマウス大脳皮質アストロサイトを、膜表面（電極形成面）にマウス海馬ニューロンをそれぞれ培養し、1週間毎にニューロンの細胞外電位を計測した。電極形成面側のみで共培養する従来法と比較したところ、SiN膜を挟んで共培養を行う本手法の方が、より多くのスパイク状の細胞外電位波形を計測し得ることが分かった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 交付申請書の研究実施計画に記載した3個の技術課題、すなわち微小孔アレイを有するSiN膜上で単一ニューロンを培養する技術、iPS細胞からニューロンを分化誘導する技術、微小電極を用いてニューロンの細胞外電位を計測する技術のいずれにおいても、当初の目標としていた成果を得ることができたため。
Strategy for Future Research Activity	微小孔アレイを有するSiN膜上で単一ニューロンを培養する技術を構築するために、以下の研究を実施する。半導体加工技術を利用してマイクロウェルをアレイ状に形成し、微小孔アレイを有するSiN自立膜で各ウェルの底面を構成する。多数のウェル内に単一ニューロンを効率的に播種する技術を構築することで、単一ニューロン培養系構築の歩留まりとスループットを向上させる。具体的には、マイクロ流路底面にニューロンより小さな微小孔をアレイ状に形成して、マイクロ流路内の圧力制御により微小孔に単一ニューロンを吸引固定した後にウェル内に吐出する方法などを検討する。次に、微小孔アレイを有するSiN膜上でiPS細胞からニューロンを分化誘導する技術を構築するために、以下の研究を実施する。SiN膜の裏面にマウス由来アストロサイトを培養した後に、グルタミン酸作動性ニューロンへの分化誘導を施したiPS細胞をSiN膜表面に培養する。SiN膜に形成した微小孔アレイを通じた細胞間コミュニケーションが分化誘導に与える影響を調べるために、グルタミン酸作動性ニューロンが特異的に有するVGLUT等のタンパク質を蛍光染色することで、ニューロンの活性を定量評価する。さらに、微小孔アレイを有するSiN膜上の微小電極を用いて単一ニューロンの細胞外電位を計測する技術を構築するために、以下の研究を実施する。SiN膜上に形成した微小電極を囲むように単一ニューロンを培養するウェルを形成し、そのウェル内にマウス由来の単一ニューロンを播種し微小電極上で培養する技術を構築する。単一ニューロンの細胞外電位を計測する基礎的な実験を行いながら課題を明確にし、微小電極の寸法や配置などの最適化に向けた指針を導出する。
Remarks	Yano E plus 2021年3月号（矢野経済研究所発行）の特集「次世代機能性薄膜の動向(6) ～バイオ機能薄膜～」の一部（pp. 7-13）において、研究成果に関する解説記事を発表した。