2020 Fiscal Year Annual Research Report
Creation of innovative myocardial regeneration strategy with soft and highly dividing cardiomyocytes
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20H04521
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
橋本 謙 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (80341080)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
毛利 聡 川崎医科大学, 医学部, 教授 (00294413)
花島 章 川崎医科大学, 医学部, 講師 (70572981)
氏原 嘉洋 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80610021)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 心筋細胞 / 分裂・再生 / 酸素環境 / Fam64a / APC/C / Novex3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心筋細胞は胎生期にのみ分裂能を有する為、成体では心筋梗塞等で失われた心筋を再生することは出来ない。我々は最近、心筋分裂には胎生期の低酸素環境が必須であり、出生後の肺呼吸開始による酸素増加が心筋分裂を停めることを突き止め、胎生期心筋の分裂を促進する三つの遺伝子[Fam64a, APC/C, Novex3]を同定した。Fam64aとAPC/Cは協調して心筋細胞周期を促進する。Novex3は核の柔軟性を増すことで心筋分裂を促進する。本研究では、これら三因子の成体心筋への導入による心筋再生の実現を目指している。
1. 心筋特異的Fam64a過剰発現マウスの解析
Fam64a発現が失われる出生後において心筋特異的にその発現を長期維持する過剰発現マウスを作製したところ、期待通り成体心筋の分裂は促進されたが、同時に心筋細胞の過剰な脱分化・未熟化が起こり、心機能が悪化した。分子機構を検討したところ、Fam64aが糖質コルチコイド受容体と複合体を形成し、心筋分化を促進する転写因子Klf15を阻害することで心筋の脱分化を促進することを明らかにした。心筋分裂には先行する脱分化とそれに伴う収縮力低下が必ず付随する為、今後は過剰な脱分化を避けつつ心筋再生を実現する為の対策として、心傷害に対する一過性のFam64a導入法の検討を進めていく。
2. 心筋特異的Fam64a KOマウスの作製
ゲノム編集によりFam64a遺伝子のexon 3,4の両端にloxPを挿入したマウスを作製し、心筋特異的Nkx2.5-Creマウスとの交配により心筋特異的Fam64a KOマウスを作製した。ゲノムレベルでの当該部位の欠損、また、mRNAと蛋白レベルでの心筋特異的Fam64a欠損を確認した。本マウスでは、Fam64aが高活性である胎生初期に心筋特異的にKOされる為、心筋分裂障害や発生異常が想定される。今後、表現型解析を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々は分裂が盛んな胎生期心筋細胞の分裂制御メカニズムを解明し、これを成体心筋へ適用することで心臓再生医療の実現を目指す研究を進めている。本年度は当初の計画通り、我々が同定した細胞分裂促進因子Fam64aの長期にわたる過剰発現が成体心筋の分裂を促進するものの、同時に過剰な脱分化により心機能を悪化させる機序を分子レベルで明らかにすることが出来た。その結果、Fam64aは単なる分裂促進因子ではなく、心筋を脱分化させることで未分化・幼若な状態に導くことを明らかにした。先述のように脱分化と分裂は表裏一体の関係にあり、心筋を分裂させようとすると脱分化・幼若化により心機能が低下するというジレンマがある。これは、常に収縮弛緩を繰り返し、休みなく働いている心臓という臓器の宿命であり、今後の心筋再生戦略を進めるうえで避けては通れない重要な課題である。我々はこれに対してFam64a等の細胞周期促進遺伝子を必要な時に必要最低限のレベルでのみ誘導する一過性導入をベースとして、その誘導条件の最適化を目指していく予定である。Fam64aの心筋特異的KOマウスについては当初の予定通りに確立することができた。その過程で一連のゲノム編集技術に習熟できたことは今後の様々な遺伝子改変動物の作出に大いに貢献できると考えている。今後は本マウスの表現型解析を進めると共に、心傷害に対する応答や、Fam64aの一過性導入による機能回復についても検討する。Fam64aと協調して働くAPC/Cについては、その分子構造が非常に複雑であることから（10以上の分子から構成される複合体）、培養心筋細胞のレベルでAPC/Cを効率よく活性化する方法を検討中であり、マウス個体への適用を鋭意進めていく予定である。Novex3についてはゲノム編集によりKOマウスを作製済みであり、その表現型について特に核の硬さや構造変化を中心に検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
【1. Fam64aの一過性導入による心筋再生】心臓冷却傷害/心筋梗塞を施した野生型成体マウスの心臓にFam64aを一過性に発現させ、心筋分裂能、脱分化状態、心機能回復を評価し、最適な遺伝子導入条件を探索する：[導入方法]in vitro合成mRNAの直接導入、心筋への導入法として汎用されるアデノ随伴ウイルス[AAV]、独自開発のバキュロウイルスによる方法を検討。[導入量]上記ベクターの投与量として調整。[導入時期]冷却傷害/心筋梗塞の手術前、手術中[同時]、手術後の投与、また、間隔を空けての複数回投与を検討。
【2. 心筋特異的Fam64a KOマウス】以下の表現型解析を進める：個体生存率、心機能、組織・単離心筋の解析。また、上記の心臓冷却傷害/心筋梗塞を施し、野生型マウスとの違いや、Fam64aの一過性導入による心機能回復を検討する。以上より、Fam64aの分子機能を明らかにし、再生戦略の構築に活用する。
【3. APC/Cとのダブル過剰発現マウス】APC/Cは細胞周期のM期においてFam64aを分解に導く因子であり、出生後はFam64aと同様にその活性が低下する。本研究では、Fam64aとAPC/Cを同時に活性化する心筋特異的ダブル過剰発現マウスを作製し、胎生期心筋で起こっているFam64aの周期的増減を成体心筋で再現することで、過剰な脱分化・幼若化を防ぎ、心機能悪化を伴わない真の心筋再生を目指す。
【4. Novex3 KOマウス】作成済みのNovex3 KOマウスの表現型について、心機能、心筋分裂能、分化・脱分化状態の解析に加えて、特に核の硬さ/サイズ/構造/配置の変化に着目して検討する。これにより、核の物理的特性と心筋の分裂・分化制御系との関連を分子レベルで明らかにし、標的分子への介入による心筋再生を目指す。核の硬さを定量する微小ニードル引張法は確立済みである。
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