2022 Fiscal Year Annual Research Report

Creation of innovative myocardial regeneration strategy with soft and highly dividing cardiomyocytes

Research Project

Project/Area Number	20H04521
Research Institution	Kawasaki Medical School
Principal Investigator	橋本謙川崎医科大学, 医学部, 准教授 (80341080)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	毛利聡川崎医科大学, 医学部, 教授 (00294413) 花島章川崎医科大学, 医学部, 講師 (70572981) 氏原嘉洋名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80610021)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	心筋細胞 / 分裂 / 分化 / 再生 / 酸素環境
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、低酸素下にある胎生期心筋の分裂を促進する三つの遺伝子[Fam64a, Novex-3, APC/C]を用いた成体心筋の再生を目指している。 1. Fam64a Fam64aを出生後長期にわたって心筋特異的に過剰発現するマウスでは、期待通り成体心筋の分裂は促進されたが、一方で心筋細胞の分化不全・脱分化による幼若化が起こり、心機能が悪化した。分子機構を検討したところ、Fam64aが糖質コルチコイド受容体と複合体を形成し、心筋分化を促進する転写因子Klf15を阻害することで幼若化を誘発していた。そこで、昨年度から新たな実験系として、心臓冷却傷害を施した成体マウスに対し、Fam64aの合成mRNAを傷害部近傍の心筋に局所的、且つ一過性に導入する系を検討してきた。本年度はその成果が得られ、上記のようにFam64aの発現を傷害部近傍のみに限局し、且つ、合成mRNAを用いることにより発現を短期間[2～3日]に限定することで、傷害後5週にわたり幼若化を起こすことなく心筋細胞周期の促進、心線維化の抑制、及び心機能の回復を実現できた。 2. Novex-3 Novex-3は筋サルコメアに局在する巨大蛋白コネクチンのshort isoformであるが、低酸素下の胎生期には心筋細胞のサルコメアだけでなく核にも局在し、核の柔軟性を増すことで心筋分裂を促進する。そこで、ゲノム編集によりNovex-3 KOマウスを作製し、本年度はその表現型を解析した。KOマウスでは胎生中期[妊娠13日目]において既に心筋細胞の分裂阻害が認められ、新生児期には心筋が肥大する傾向にあった。その後、加齢と共に心肥大が進行して心不全に陥り、生存率が低下した。分子機構を検討したところ、KOマウス心筋では、胎生期において核周囲での微小管の蓄積と核の硬化[弾性率の低下]が認められ、このことが分裂阻害と関連する可能性が示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 心筋細胞は胎生期にのみ分裂能を有する為、成体では心不全等で失われた心筋を再生することは出来ない。我々は最近、心筋分裂には胎生期の低酸素環境が必須であり、出生後の肺呼吸開始による酸素増加が心筋分裂を停めることを突き止め、胎生期心筋の分裂を促進する三つの遺伝子[Fam64a, Novex-3, APC/C]を同定した。本研究では、これら三遺伝子を用いた心筋再生を目指している。このうち、現時点でFam64aについての解析が最も進んでいる。本年度は、心傷害を施した成体マウスに対してFam64aを傷害部近傍の局所のみに一過性に導入発現する系を確立し、長期過剰発現マウスで問題となっていた心筋幼若化を誘導することなく細胞周期を促進し、心線維化の抑制と心機能回復を実現することが出来た。このことは、分化と分裂に関するジレンマ、即ち、心筋を分裂させようとすると幼若化により心機能が低下するという不可避の問題に対する突破口となる有望な成果である。並行して解析を進めている心筋特異的Fam64a KOマウスの解析は来年度に進める予定であるが、ゲノムレベルでの欠損、mRNAと蛋白レベルでの心筋特異的Fam64a欠損を確認済みである。Novex-3については、KOマウスの表現型を解析したところ、胎生期において心筋細胞の核周囲に微小管が蓄積し、核が硬化することにより心筋分裂が阻害されていることが示唆された。このような発生早期の心筋分裂の障害が代償的な心肥大を誘発し、加齢と共に心不全に陥った可能性が考えられた。今後は、Novex-3による微小管集積、核物性、心筋分裂の制御機構を解明し、成体心筋への導入による再生を目指す。Fam64aと協調して働くAPC/Cについては、その分子構造が非常に複雑であることから（10以上の分子から構成される複合体）、培養心筋レベルでAPC/Cを効率よく活性化する方法を検討中である。
Strategy for Future Research Activity	[Fam64a]Fam64aの心筋細胞周期の促進機序を解明するため、心筋特異的Fam64a-KOマウスを用いた解析を行う。本マウスでは、Fam64aが胎生初期に心筋特異的にKOされる為、心筋分裂障害や発生異常が想定される。また、本マウスの心傷害に対する応答やFam64aの一過性導入による機能回復についても検討する。一過性導入については臨床応用を想定し、傷害の種類/強度/範囲、また、導入媒体/量/時期について最適条件を決定する。更に、哺乳類に比べて強い心再生能を有する魚類ゼブラフィッシュにおけるFam64aの過剰発現・KO動物の表現型を解析する。 [Novex-3]Novex-3による微小管集積、核物性、及び心筋分裂の制御機構を明らかにする為、KOマウスからの単離心筋を用い、微小管の脱重合促進剤、安定化剤、また、微小管と深く関連する中心体、核と細胞骨格を繋ぐLINC複合体のノックダウン・過剰発現、更に、核物性の決定因子であるLamin量やクロマチン凝集度の増減等の介入処置に対する細胞分裂活性、核物性変化を解析する。更に、哺乳類に比べて強い心再生能を有する両生類アホロートルの心筋を用い、核物性と分裂能の相関関係（軟らかい核を持つ心筋細胞は分裂再生能が高い）が種を超えて保存されている可能性を探る。 [APC/C]APC/CはM期におけるFam64aの分解因子であり、細胞周期における周期的なFam64aの増減を実現すると共に、Fam64aの蓄積による心筋幼若化を抑制していると考えられる。APC/Cの活性化因子Cdc20に着目してその活性化条件を探索し、Cdc20の心筋特異的過剰発現マウスを作製する。これをFam64a過剰発現マウスと交配し、Fam64aの周期的増減を成体心筋で再現することで、Fam64a単独過剰発現マウスで問題であった心筋幼若化を抑制し、心傷害からの回復促進を目指す。