2020 Fiscal Year Annual Research Report
Development of Antibody Drug Delivery System to the Brain
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20H04525
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
安楽 泰孝 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 特任准教授 (60581585)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 薬剤送達システム / スマートベシクル / 血液脳関門 / 抗体医薬 / 高分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脳は血管内皮細胞間の結合が極めて強固なために、血管内腔から脳実質部への物質輸送が著しく制限されている(血液脳関門: BBB)。そのために、アルツハイマー病(AD)等の脳神経系(CNS)疾患の治療に十分量の薬剤を、全身投与によって脳実質部に送達し、機能させられない事が大きな課題となっている。すなわち、「BBBを越えて、抗体等の高分子医薬を高効率で脳実質部に送達して機能させる方法論を創出できるか？」という「問い」はまさにCNS疾患の抜本的治療が実現できるかどうかの核心であり、これまでにも世界各国の研究グループによって様々なアプローチが検討されてきたものの、未だ達成されていない挑戦的な研究課題である。この課題を解決するために本研究では、BBBを突破して脳実質部に浸透し、さらには脳内環境に応答して抗体医薬を放出することで機能を発現させるウイルス・サイズの薬剤送達システム(DDS)を、生体適合性に優れた高分子材料の自己組織化に基づいて構築し、CNS疾患の革新的治療法を確立することを目的とする。
当該年度は、まず本研究課題の基礎的な部分について検討を行なった。具体的には、①本課題でプラットフォームとなる3種類の異なる機能を有する高分子の合成、②抗体を内水相に安定に封入したスマートベシクル(IgG@SV)の構築と基礎物性評価について検討を行なった。特に②については、次年度以降に計画しているin vitro、in vivo試験の前準備として、より生体・脳内に近い環境における実験を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画を通り、3種類の異なる機能を有する高分子合成・評価、IgG@SVの調製・評価、その基礎的な物性評価を進めた結果、下記の特筆すべき成果を得ることに成功した。
1) 生体適合性の高いポリエチレングリコール(PEG)とカチオンセグメントにポリリジン(PLL)から形成されるブロック共重合体を基本骨格とし、PEGセグメントとPLLセグメント間に脳内の還元環境に応答して開裂する官能基を導入した高分子を合成した。それぞれの高分子は、PEGのα末端にa) BBBを通過するためのグルコース、b) BBB通過後に脳内動態を制御するリガンド分子を搭載するアジド基、c) 生体内での反応性のないメトキシ基を導入した。合成した高分子は核磁気共鳴法、高速液体クロマトグラフィーを用いて、各セグメントの重合度、分散度を測定し、所望の高分子が得られていることを確認した。またブロック共重合体について、血液中を模倣した環境と脳内を模倣した環境中でインキュベートしたところ、脳内環境においてのみ高分子の分解を確認した。
2) 上記で得られた3種類の高分子と抗体(IgG)を任意の割合で混合しIgG@SVを調製し、動的光散乱測定と透過型電子顕微鏡観察より、直径が120 nmで単分散な中空粒子であることを確認した。また蛍光標識したIgGを用いて、混合するIgGの割合を変えてIgG@SVを調製し蛍光相関分光測定を行ったところ、SV１粒子あたりのIgG封入数を1~3個まで制御可能であることを明らかに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに、①本研究課題でプラットフォームとなる高分子合成、それを用いたIgG@SVの調製と物性評価を行なってきた。今後は最適化したIgG@SV(1粒子あたり3個のIgGを封入)を用いて、SV表層のグルコースリガンドのGLUT1認識能の評価、② 脳内環境を模倣した還元環境におけるIgG@SVからのIgGの放出挙動、③アルツハイマー病マウス由来の培養脳切片を用いた放出されたIgGのAβ結合能について検討する。
1) 表層に存在するグルコースリガンドの%を変えたIgG@SVを、GLUT1を発現するMDA-MB231細胞に播種し、細胞取り込み試験、GLUT1への結合能を共焦点顕微鏡で評価する。加えてGLUT1阻害剤であるフロレチンを加えIgG@SVと共培養し、同様に取り込み試験を行い、SV表層のグルコースリガンドを介して細胞に取り込まれていることを確認する。
2) IgG@SVをa) 血液を模倣した環境、b) 脳内を模倣した環境に静置し、IgGの放出挙動を検討する。蛍光標識したIgGを用いて、蛍光相関(相互相関)分光法(FCS, FCCS)を用いて評価する。コントロールとして、環境応答性を有さないSVを用いて同時に評価を行う。
3) アルツハイマー病モデルマウス由来の培養脳切片を用いて、IgG@SVから放出されたIgG(Aβ抗体)のAβ認識能について蛍光顕微鏡で評価する。ここではAβをチオフラビンTで蛍光染色し、IgG由来の蛍光とAβ由来の蛍光との局在より、IgGの標的指向性を確認する。
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