2021 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of mechanical and biological effects of oscillating microbubbles on capillary endothelial cells and extravasation
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20H04542
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
工藤 信樹 北海道大学, 情報科学研究院, 准教授 (30271638)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 亮 帝京大学, 薬学部, 教授 (90384784)
松崎 典弥 大阪大学, 大学院工学研究科, 教授 (00419467)
佐々木 東 北海道大学, 獣医学研究院, 講師 (00754532)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 超音波 / 微小気泡 / 薬物送達 / 血液脳関門・血液腫瘍関門開放 / 血管ファントム / 3次元培養 / 高速度・共焦点観察 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血管内に微小気泡と薬剤を投与し，超音波照射により血液脳関門や血液腫瘍関門を一時的に開放する手技の実現を目指して以下の検討を行った．
【血管の物理特性を模擬するゲルファントムの開発】 ゲルファントムを肉厚円筒として取り扱うこととし，厚肉円筒の弾性率の解析式について調査した．解析式に基づき，内腔に加わる拡張圧力と内腔径の増加量から弾性率を求める式を導出した．膨張する気泡が内腔に加える圧力と高速度観察像の内腔径増加量から求めた弾性率は，実験に用いたゲルの準静的弾性率と大きく異なることを確認し，その理由が，動的弾性率が周波数依存性を持ち，超音波周波数帯の動的弾性率が不明であることに起因することを指摘した．
【組織構造を模擬する3次元培養細胞血管ファントムの開発】 線維芽細胞と内皮細胞の共培養による毛細血管ファントムの作成方法は，内皮細胞単独のファントムの作成方法に比べプロセスが複雑であり，再現性が非常に低かった．これを改良するため本年度は作成プロセスの改良を行った．その結果，模擬薬剤や微小気泡を管腔内部に導入できる程度には歩留まりが向上した．しかし，管腔内に導入した気泡の超音波照射下におけるダイナミクスの観察には至らなかった．
【樹状細胞の機械刺激受容特性】 超音波照射により樹状細胞を成熟させ，免疫治療の効率を向上させることを最終的な目的として，超音波照射による樹状細胞の機械機械刺激の可能性について検討した．その結果，微小気泡を貪食した条件の樹状細胞では，診断装置レベルの超音波短パルスの照射で細胞内カルシウム濃度上昇を繰り返し誘導できることを確認し，機械刺激による樹状細胞の成熟促進の可能性を示した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
【血管の物理特性を模擬するゲルファントムの開発】 微小気泡の直径には大きなばらつきがあり，気泡のダイナミクスは気泡の初期径に依存する．それゆえ，ダイナミクスの全般的な傾向を捉えるためには，多数の気泡の観察が必要である．ゲル管腔内の気泡に超音波を照射してダイナミクスを観察し，超音波音圧と内腔拡張量の関連のゲル硬さ依存性を調べる実験を来年度も継続する必要がある．また，ゲルの超音波周波数帯域における動的弾性率評価の必要性が明確となったため，それに向けた検討も必要である．
【組織構造を模擬する3次元培養細胞血管ファントムの開発】 本年度，線維芽細胞と内皮細胞の共培養による毛細血管ファントムの作成プロセスの改良を行った結果，ファントム作成の歩留まりは改善したが，管腔内に導入した気泡に超音波を照射する実験までは至らなかった．コロナ禍により研究室への出入りが大きく制限され，テクニシャンの雇用もできなかったことが原因の1つである．
【生体試料顕微観察法】 調査の結果，麻酔下で腸間膜を体外に引き出し顕微観察する手法は秘術的ハードルが高いことが判明した．そこで，ラットから切除した腸間膜を用いて，超音波照射下における毛細血管内での微小気泡のダイナミクス，種々の分子量のFITC標識デキストランの漏出，内皮細胞の損傷をex vivoで観察する手法の実現可能性について検討する．
【樹状細胞の機械刺激受容特性】 本年度は，超音波照射による樹状細胞の機械刺激の可能性を，気泡を貪食した細胞について検討した．超音波照射による細胞の機械刺激の適応範囲拡大するためには，微小気泡を貪食しない細胞に関する検討も必要である．
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| Strategy for Future Research Activity |
【血管の物理特性を模擬するゲルファントムの開発】 ゲル管腔内の気泡に超音波を照射して気泡が管腔を膨張させる様子を高速度撮影し，超音波音圧と内腔拡張の関連のゲル硬さ依存性を調べる検討を続けるとともに，ゲルの超音波周波数帯域における動的弾性率を評価する手法について検討する．これを行うために，超音波照射下での気泡の径変化をレーリープレセット方程式によるシミュレーションを実施する．
【組織構造を模擬する3次元培養細胞血管ファントムの開発】 線維芽細胞と内皮細胞の共培養による毛細血管ファントムは，作成プロセスにおいて制御すべきパラメータが多く歩留まりが非常に低い．来年度は，共培養細胞数の比率，基材となるゲルの硬さ，血管開口端形成条件に関するパラメータの最適化を行う．作成したサンプルの内腔に模擬薬剤と微小気泡を導入し，超音波照射下での微小気泡のダイナミクスの高速度撮影，超音波照射による模擬薬剤漏出と細胞への作用を共焦点蛍光観察により明らかにする．
【生体試料顕微観察法】 調査の結果，麻酔下で腸間膜を体外に引き出し顕微観察する手法は秘術的ハードルが高いことが明らかとなってきた．そこで，ラットから腸間膜を切除し，ex vivoで超音波照射下における毛細血管内での微小気泡のダイナミクス，種々の分子量のFITC標識デキストランの漏出，内皮細胞の損傷を観察する手法の実現可能性について検討する．
【樹状細胞の機械刺激受容特性】 本年度は，超音波照射による樹状細胞の機械受容チャネルトリガの可能性を，気泡を貪食した細胞について検討した．来年度は，超音波照射による細胞の機械刺激の適応範囲拡大を目的として，微小気泡を貪食しない樹状細胞の超音波機械刺激の可能性について検討する．
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