2020 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the molecular mechanism of tendon and ligament homeostasis
| Project/Area Number |
20H05696
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
|---|
Principal Investigator |
淺原 弘嗣 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (70294460)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-08-31 – 2025-03-31
|
| Keywords | 腱・靱帯 / Mkx / 運動機能 / 遺伝子発現 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
運動器は、筋と骨・軟骨が腱・靱帯によって正確かつ強靭に結ばれることで機能を発揮し、適切な運動刺激においてその機能が向上するが、腱・靱帯がどのように、運動刺激を感知し、さらにホメオスタシス（恒常性）を維持するかについては、詳細な分子機構は未だに不明である。我々は、腱組織の中に存在し、腱の発生および恒常性を司る腱細胞の動態に注目、その腱細胞の分化と活動維持が転写因子Mkxによって担われるとの自身の研究成果に基づき、さらに、腱細胞におけるMkxの活性化が、腱の肥大・強化を引き起こすメカニズムを解析した。まず、腱組織に含まれる細胞群を一細胞レベルで解析し、腱細胞やその起源となる細胞群を同定した。その過程で、Mkxが腱細胞における重要なマーカーであることが再確認できた。さらに、Mkxの腱における機能を探索する目的で、Mkx遺伝子を編集した複数のマウスを作成し、Mkxによる腱細胞の遺伝子ネットワークの解明を行った。さらに、運動刺激が腱細胞にあたえる影響を、個体および細胞レベルで検証し、その一連の遺伝子プログラムを解析した。これらの実験から得られた情報を基に、ヒトの腱組織における腱細胞の機能を比較検討し、ヒト腱細胞においてもMkxを中心とした腱特異的な遺伝子プログラムが存在し、その活性化によって、腱の恒常性維持が担われることが予想された。これらの研究により、運動器の要としての腱・靱帯の機能の一端が明らかとなり、将来の腱組織の疾患、損傷や加齢に対する医療応用への基盤を提供した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1)成体における腱細胞でのMkxの機能を探索 Mkxが腱細胞の恒常性維持に必須の転写因子であることを証明し、詳細な遺伝子ネットワークを解明するため、MkxGFP:CreERマウス、Mkxfloxマウスという遺伝子改変マウスを準備した。ＧＦＰの発現が腱・靱帯特異的であるのみならず、発生初期から、成熟した腱細胞にまで高いレベルで続くことを確認し、CreERの発現が、同時に新規作成されたMkxのfloxコンディショナルマウス（Mkxfloxマウス）との掛け合わせから得られた成体マウスの初代腱細胞において、in vitroでのタモキシフェン（4-OHT 5μMに24時間暴露）の投与によりMkx alleleを有効に欠失させ解析を行った。また、現在、MkxGFP:CreER;Mkxfloxマウスと MkxGFP:CreERマウス成体でタモキシフェンを用いてCreを誘導し、その後各種マウスからGFPでソーティングした陽性細胞を抽出しRNA seqを行い、Mkxの腱・靱帯を維持する下流因子のネットワークの解明を行っている。
2）腱・靱帯における時空間特異的Mkx遺伝子編集マウス個体の作成 成熟した腱細胞における時空間特異的なMkx遺伝子変異を誘導するため、MkxGFP:CreERマウスおよびMkxGFP:CreER;floxマウスを作成した。現在、筋・腱・靱帯・骨格系が成熟した後にMkxが与える影響についてフェノタイプの解析中である。
3) ヒト腱細胞を用いたトランスクリプトーム解析 手術サンプルから得られるヒト腱・靱帯組織からヒト初代腱細胞を抽出した。今後、一細胞レベルでのトランスクリプトーム解析を行う予定である。
以上、ほぼ当初の計画通り、順調に進んでいる
|
| Strategy for Future Research Activity |
1)腱細胞におけるMkxのメカノセンサーとしての機能解析 in vitroにおいて、より直接的にメカノストレスからMkxへのカスケードが腱細胞におけるメカノセンサーとして、どのように機能するのかを解析するため、昨年度に作成された、MkxGFP:CreERマウスおよびMkxGFP:CreER;floxマウスのアキレス腱から初代腱細胞を採取し、タモキシフェン処置後、細胞に対するメカニカルな刺激の影響を評価する。まず、腱細胞を播種し、4-OHT（5μM）により24時間、リコンビネーションを誘導、目的とする遺伝置換が80％以上の高率で行われることを確認する。次に、腱細胞をI型コラーゲンコーティングチャンバーに播種し、同処置でリコンビネーションを誘導した後、FX-5000組織張力システム（Shellpa Pro Co.、Ltd）を使用して、ストレッチ幅および周波数を調整し腱細胞に伸長刺激を与え、トランスクリプトーム解析によって、Mkxおよび他の腱関連遺伝子発現を解析する。
2）腱・靱帯におけるMkxの運動能力への影響 昨年度に作成したMkxGFP:CreERマウスおよびMkxGFP:CreER;floxマウスを使用する。腱が成熟する生後4ヶ月のマウスでタモキシフェン投与（5日間連続で100 mg / kgを注射しその後1週間間隔を空ける）を行い、実験を開始する。瞬発力を測定する運動試験として① Modified long jump testを、持久力を測定する検査として② Run-to-Exhaustion testと③ Hanging wire testを実施する。これによって、Mkxの運動機能に及ぼす影響を解析する。
|
Research Products
(8 results)
