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2021 Fiscal Year Annual Research Report

べん毛モーター固定子の構造変化により生じるエネルギー変換機構の解明

Research Project

Project/Area Number 20J00329
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

錦野 達郎  大阪大学, 大阪大学蛋白質研究所, 特別研究員(PD) (80884428)

Project Period (FY) 2020-04-24 – 2023-03-31
Keywords細菌べん毛モーター / 固定子 / エネルギー変換 / クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 / 溶液NMR / イオンチャネル
Outline of Annual Research Achievements

細菌の運動器官の一つであるべん毛は、回転するモーターをもつ超分子複合体である。モーターは自身が回転する「回転子」と回転子の周りに集合しイオンチャネルとして機能する「固定子」の2種類の複合体から成る。モーターの回転は、固定子への共役イオンの流入とカップルした回転子と固定子の相互作用により、膜内外に形成される電気化学ポテンシャル差が運動エネルギーに変換されることで生じる。固定子は、5分子のAサブユニット(PomA)と2分子の Bサブユニット(PomB) からなる膜貫通タンパク質複合体である。その構造はクライオ条件下での単粒子解析により明らかになっているが、エネルギー変換の際の複合体の構造変化や共役イオンの通り道は未だによくわかっていない。本研究では、これらを明らかにするためにNa+チャネルである海洋性ビブリオ菌の固定子複合体[PomA/PomB]の構造情報をクライオ条件での単粒子解析と溶液核磁気共鳴法(NMR)により取得することを目的としている。
昨年度(研究初年度)は、クライオ条件での単粒子解析法の取得のために高度好熱菌Aquifex aeolicusの固定子Aサブユニット(MotA)複合体の解析とNMR解析技術の習得のために固定子の相互作用相手であり回転子を構成するタンパク質の一つであるFliGの解析を進めた。現在、これら2つの研究成果を論文にまとめ投稿する準備を進めている。
今年度は、クライオ条件でのPomAPomB複合体の単粒子解析を進めた。複合体の密度マップを得ることができたため、モデル構築と精密化の作業を進めている。溶液NMRでの解析では、複合体中のメチオニン残基側鎖のメチル基を13C標識した測定試料を調製し、NMR測定を行った。野生型とNa+イオン透過が阻害されるD24N変異体のスペクトルを取得し比較したところ、スペクトルの変化が見られた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度までにクライオ条件でのPomAPomB複合体の単粒子解析では、撮影用の試料を調製しクライオグリッドのスクリーニングを行ったところ、試料の変性や凝集が見られていた。そこで本年度は、試料の変性や凝集が抑えられる条件の検討を行った。その結果、比較的試料の変性や凝集が抑えられる条件を見つけることができたため、受け入れ研究機関の大型装置の一つであるTitan Kriosクライオ電子顕微鏡で試料の撮影を行った。単粒子解析ソフト Relion 3.1を用いて、得られたデータの単粒子解析を行ったところ、4オングストロームを切る分解能を持つ密度マップを得ることができた。このマップを用いて、PomAPomB複合体のモデル構造の構築と精密化の作業を進めている。
PomAPomB複合体のモデル構造構築のめどが立ったこともあり、PomAPomB複合体の溶液NMR解析にも着手した。溶液NMR法ではタンパク質を安定同位体標識した試料が 0.1 mM程度の濃度で 0.3 ml程度必要である。また、分子量が大きいほどシグナルの数の増加や線幅の広がりが見られ解析が困難になることから、分子量30 kDa程度のタンパク質が解析の限界であった。PomAPomB複合体は、分子量約200 kDaの膜タンパク質複合体であり、その分子量と収量(LB培地 1 Lの培養から試料1 mg/ml程度の収量 (0.005 mM))から、一般的なタンパク質の試料調製法では解析が困難であることが予想されていた。そこで、比較的感度がよく測定試料の濃度が0.01 mM程度でも構造情報の取得が可能なメチオニン残基側鎖のメチル基を13C標識したPomAPomB複合体試料を調製し、NMR測定を行った。野生型とD24N変異体の1H-13C HMQCスペクトルを取得し、比較したところ、スペクトルに変化が見られた。

Strategy for Future Research Activity

PomAPomB複合体の単粒子解析では、モデル構造の完成を目指す。得られたモデル構造からイオン透過に重要な残基を推定して変異体を作成することで、変異により生じる構造変化とモーターの回転への影響を調べる。そのうえで、D24N変異体や新たに作成した変異体で機能に変化が見られるものの単粒子解析を進める。
NMR解析では、共役イオンであるNa+の濃度を変化させてメチオニン残基側鎖メチル基のスペクトルを取得することで、Na+の結合や透過によって生じる構造変化を解析する。ケミカルシフト変化が見られるメチオニン残基を特定するためにシグナルの帰属も進める。変異体の作成とその解析が順調に進んだ場合は、特徴的な変異体でもメチオニン残基側鎖メチル基のスペクトルを取得に着手する。
昨年度まで必要な解析がほとんど済んでおり論文化を進めているAqufex aoelicus MotAの単粒子解析と溶液NMRでのFliGの構造解析の内容は論文の投稿を目指す。PomAPomA複合体の単粒子解析と溶液NMR解析の内容も論文化を進める。

  • Research Products

    (11 results)

All 2022 2021

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results) Presentation (7 results)

  • [Journal Article] Achievements in bacterial flagellar research with focus on <i>Vibrio</i> species2022

    • Author(s)
      Homma Michio、Nishikino Tatsuro、Kojima Seiji
    • Journal Title

      Microbiology and Immunology

      Volume: 66 Pages: 75~95

    • DOI

      10.1111/1348-0421.12954

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Hoop-like role of the cytosolic interface helix in <i>Vibrio</i> PomA, an ion-conducting membrane protein, in the bacterial flagellar motor2022

    • Author(s)
      Nishikino Tatsuro、Sagara Yugo、Terashima Hiroyuki、Homma Michio、Kojima Seiji
    • Journal Title

      The Journal of Biochemistry

      Volume: 171 Pages: 443~450

    • DOI

      10.1093/jb/mvac001

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A slight bending of an α-helix in FliM creates a counterclockwise-locked structure of the flagellar motor in <i>Vibrio</i>2021

    • Author(s)
      Takekawa Norihiro、Nishikino Tatsuro、Yamashita Toshiki、Hori Kiyoshiro、Onoue Yasuhiro、Ihara Kunio、Kojima Seiji、Homma Michio、Imada Katsumi
    • Journal Title

      The Journal of Biochemistry

      Volume: 170 Pages: 531~538

    • DOI

      10.1093/jb/mvab074

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] ZomB is essential for chemotaxis of <i>Vibrio alginolyticus</i> by the rotational direction control of the polar flagellar motor2021

    • Author(s)
      Takekawa Norihiro、Nishikino Tatsuro、Hori Kiyoshiro、Kojima Seiji、Imada Katsumi、Homma Michio
    • Journal Title

      Genes to Cells

      Volume: 26 Pages: 927~937

    • DOI

      10.1111/gtc.12895

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Aquifex aeolicus の固定子A サブユニット5量体の単粒子解析2022

    • Author(s)
      錦野達郎
    • Organizer
      べん毛研究交流会
  • [Presentation] 超好熱菌 Aquifex aeolicusのべん毛固定子タンパク質 MotAの Cryo-EMによる単粒子解析2021

    • Author(s)
      錦野達郎, 竹川宜宏,岸川淳一, 廣瀬未果, 小嶋誠司, 本間道夫, 加藤貴之, 今田勝巳
    • Organizer
      日本生体エネルギー研究会第47回討論会
  • [Presentation] Structurer of a pentameric complex of MotA, a bacterial flagellar stator protein, from Aquifex aeolicus by single particle cryo-EM2021

    • Author(s)
      Tatsuro Nishikino, Norihiro Takekawa, Jun-ichi Kishikawa, Mika Hirose, Seiji Kojima, Michio Homma, Takayuki Kato, Katsumi Imada
    • Organizer
      第59回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] NMR analysis of the conformational transition of flagellar rotor protein FliG, that determines flagellar rotational direction in marine Vibrio2021

    • Author(s)
      Tatsuro Nishikino, Seiji Kojima, Michio Homma, Yohei Miyanoiri.
    • Organizer
      PDBアジア地区50周年記念シンポジウム~アジア地区構造生物学の最先端とProtein Data Bank 50年の歩み~
  • [Presentation] 高度好熱菌 Aquifex aeolicus のべん毛モーター固定子 A サブユニットの単粒子解析2021

    • Author(s)
      錦野達郎, 竹川宜宏,岸川淳一, 廣瀬未果, 本間道夫, 加藤貴之, 今田勝巳
    • Organizer
      第74回日本細菌学会関西支部総会
  • [Presentation] Cryo-EM による超好熱菌 Aquifex aeolicus 由来べん毛モーター固定子A サブユニット MotA 5 量体の構造2021

    • Author(s)
      錦野達郎, 竹川宜宏,岸川淳一, 廣瀬未果, 本間道夫, 加藤貴之, 今田勝巳
    • Organizer
      第67 回日本生化学会近畿支部例会
  • [Presentation] . Characterization of the Conformational Exchanges of Flagellar Rotor Protein FliG, that Induces the Rotational Switching of the Bacterial Flagellar Motor2021

    • Author(s)
      Tatsuro Nishikino, Seiji Kojima, Michio Homma, Yohei Miyanoiri.
    • Organizer
      ISMAR-APNMR

URL: 

Published: 2022-12-28  

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