2020 Fiscal Year Annual Research Report

イメージングとプロテオミクスから迫るミトコンドリアDNA母性遺伝の統合的理解

Research Project

Project/Area Number	20J01777
Research Institution	Gunma University
Principal Investigator	佐々木妙子群馬大学, 生体調節研究所, 特別研究員(PD)
Project Period (FY)	2020-04-24 – 2023-03-31
Keywords	ミトコンドリア / 母性遺伝 / オートファジー
Outline of Annual Research Achievements	ほとんどの真核生物でミトコンドリアDNA（mtDNA）は片親遺伝，主に母性遺伝する．この現象は真核生物にとって非常に重要な現象であると考えられるが，長年その分子メカニズムは未解明であった．最近になり，受精後の父性ミトコンドリア（父性mt）と内部のmtDNAが，細胞内分解システムの一つであるオートファジーによって分解・除去されることが，モデル生物である線虫C. elegansを用いて初めて示された（Sato and Sato,2011）．一方で，なぜ父性mtだけが周囲の母性オルガネラと区別され，選択的にオートファジーに導かれるのか，ほとんど分かっていなかった．本研究では，イメージング，プロテオミクス，遺伝学的手法の３つの手法で父性mt選択的分解の仕組みを解析し，母性遺伝の分子モデルの構築を目指した．本年度は，父性mt選択的分解に関わる因子が局在化するタイミングを詳細に解析するために，まず，線虫の受精過程のライブイメージング法の開発を行った．新たな低刺激観察法の考案を行い，線虫の素早い受精過程を捉えることに成功した．これまでに，新規アダプター分子ALLO-1，およびTBKファミリーキナーゼであるIKKE-1が，父性mtの選択的分解に必須であることが示され（Sato et al., 2018），これらの分子が選択的オートファジーを制御する仕組みの解明が待たれていた．そこで，本研究で開発したライブイメージング法を用い，受精直後の各因子の局在化の様子を詳細に解析した．その結果，ALLO-1やIKKE-1は受精後わずか30秒以内に局在化することが分かった．またIKKE-1を欠損するとALLO-1の集積が不完全になることも分かった．さらに，質量分析によりIKKE-1のリン酸化ターゲットを探索し，IKKE-1によるリン酸化を介してALLO-1の局在化を制御する因子の同定に成功した．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究では，イメージング，プロテオミクス，遺伝学的手法の３つの手法で父性ミmtが選択的に分解される仕組みを多面的に解析し，母性遺伝の分子モデルの構築を目指している．本年度の研究から，以下に示すように受精研究に必須のイメージングツールの開発を行い，それを用いていくつかの重要な知見が明らかとなった． ①線虫の受精過程のライブイメージング法の開発：線虫の受精過程は，光，温度，湿度，線虫の動きを止めるための薬剤の影響など些細な刺激で停止してしまうため，これまでライブイメージングは非常に困難だった．本年度の研究から，新たな観察法を開発し，非侵襲的に観察することを可能にした．また，プレート型インキュベーター，および低侵襲イメージングが可能なニポウディスク式共焦点顕微鏡を用い，非常に安定的に線虫の素早い受精過程を捉える技術の確立に成功した． ②父性mt選択的分解における各因子の集積のタイムコースの解明：①で開発したライブイメージング法を用い，父性mt選択的分解において重要と考えられる因子のイメージングを行った．その結果，受精後わずか30秒以内でALLO-1とIKKE-1が父性mtに局在化を開始し，直後にオートファジー開始複合体の集積が起こった．そしてその数分後にオートファゴソームの形成が起きることが分かった． ③父性mt選択的分解におけるIKKE-1の役割の解明：これまで分かっていなかった，IKKE-1の父性mt選択的分解における役割の一端を明らかにすることができた．ライブイメージングと質量分析を用いた詳細な解析の結果，IKKE-1はオートファジー開始複合体の一部のタンパク質のリン酸化を介して，ALLO-1の集積を制御することが分かった．以上の研究成果は，当初の目標通り，近日中に論文として投稿予定であり，おおむね順調に研究が進展したといえる．
Strategy for Future Research Activity	本研究の次の段階として，なぜALLO-1やIKKE-1が受精直後に素早く父性ミトコンドリアを選択的に認識できるのかを解明する必要がある．線虫では，オートファジーに先立って父性ミトコンドリアの膜電位の消失や融合活性の消失，ROSの産生，ユビキチン化などの変化が起きることが示唆されている（Zhou et al., 2016, Henau et al., 2020, Sato, unpublished）．また，精子形成段階でmtDNAが減少する生物種の報告もあり，これらの父性mtに起きる変化がALLO-1やIKKE-1の局在化の引き金となる可能性があるが，そうした現象の因果関係は全く分かっていない．そこで来年度は，ALLO-1とIKKE-1の局在化と，受精前後の父性mtに起こる変化との関係性を調べるため，以下の実験を行う予定である． ①精子ミトコンドリア（精子mt）のタンパク質組成の解析：質量分析により単離精子mtのタンパク質組成を卵子ミトコンドリアの組成と比較解析し，精子mt特異的に増減するタンパク質を網羅的に同定する．同定した精子mt特異的タンパク質について，RNAiにより網羅的に発現抑制し，ALLO-1の局在化に影響を与える因子を探索する． ②ALLO-1の結合因子の解析：今年度までに，免疫沈降法と質量分析を組み合わせ，ALLO-1と結合する因子を多数同定している．これらを網羅的にRNAiで発現抑制したところ，父性mt選択的分解を完全に抑制する因子は見つからなかったが，弱く抑制する因子がいくつか見つかった．このため，これらの因子が重複してALLO-1の局在化を制御している可能性がある．来年度は，これらの因子の関係性，および機能を詳細に解析する．