2021 Fiscal Year Annual Research Report
合成糖鎖の代謝取り込みを利用した好熱性古細菌における翻訳後修飾糖鎖の機能解析
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20J20284
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
平尾 宏太郎 大阪大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| Keywords | リン酸化 / グリコシル化 / 超好熱菌 / イノシトール / N-グリカン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
N結合型糖鎖（N-グリカン）は，タンパク質のアスパラギン側鎖に結合した翻訳後修飾糖鎖で，真正細菌・古細菌・真核生物の全ドメインの生物が保持し，様々な生命現象に関与する．本研究では，超好熱性古細菌 Thermococcus kodakarensisに着目し，そのN-グリカンについて，ドリコールを利用し合成糖鎖を代謝系へ取り込ませ，糖鎖の機能を評価し，その普遍的な機能に迫ることを目的とした．
合成N-グリカンを用いた構造解析の結果から，T. kodakarensisのN-グリカンの構成成分であるmyo-イノシトールの立体化学がL- myo-イノシトール-1-リン酸であることが示唆された．本年度は，このN-グリカンの合成を達成し，その立体を確定した．この合成では，イノシトールに対するα選択的なカラクトサミンの導入が鍵となった．2，3，4，6位をすべてBn基で保護したガラクトサミン供与体をEt2O溶媒中でグリコシル化することで，α選択的なガラクトサミンの導入に成功した．その後，2糖（GLu-GaLNAc）の連結，保護基の除去によって，L- myo-イノシトール-1-リン酸含有N-グリカンを合成した．このN-グリカンのNMRスペクトルは，単離したN-グリカンと良い一致を示し，これによりイノシトールの立体化学を決定することができた．本研究で確立した合成法により，T. kodakarensisのN-グリカンを天然・非天然構造も供給可能で，糖鎖が耐熱性獲得果たす役割を明らかにし，糖鎖の普遍的な機能に迫る基盤を確立できた． さらに，合成糖鎖を細胞へ取り込ませるため， N-グリカンの生合成に用いられるドリコールを活用し，ドリコールマンノースリン酸の動体解析を行った．ドリコールと蛍光基修飾マンノースリン酸の複合体を細胞外に添加したところ，原形質膜に挿入し，小胞体へ局在することを見出した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
超好熱性古細菌Thermococcus kodakarensisのN-グリカンが耐熱性獲得への寄与を分子レベルで解析するために，この糖鎖を合成した．これにより， N-グリカンの構造を確定し，純粋に十分量供給することが可能となった．昨年度までに，超好熱性古細菌T. kodakarensisのN-グリカンの単離し，その構造の推定に成功した．合成N-グリカンによるNMR解析から，推定構造に含まれるイノシトール部分の立体化学がL体であることが示唆された．本年度は，L- myo-イノシトール-1-リン酸含有N-グリカンを合成した．この合成では， i）イノシトールに対する位置選択的アシル化，ii）イノシトールに対するα選択的ガラクトサミン導入を検討した．i）では，ヒドロキシ基の反応性の差を利用して，反応温度，アシルドナーの当量を調節することでイノシトール5位選択的なアシル化を達成した．続いて，ii）では，ガラクトサミン供与体の保護基を4,6ベンジリデンアセタール保護からベンジル保護に変更することで，α選択的にガラクトサミンの導入に成功した．その後，2糖（GLu-GaLNAc）の連結，保護基の除去によって，L- myo-イノシトール-1-リン酸含有N-グリカンの合成を達成した．このN-グリカンは，単離したN-グリカンとNMRが良い一致を示し，天然体のイノシトールの立体化学の決定に至った．
合成糖鎖を利用し，T. kodakarensisの耐熱性への寄与を解析するため，糖鎖を代謝的にN-グリカンの生合成系へ取り込ませることを計画している．本年度， N-グリカンの生合成で，その担体脂質として働くドリコールを利用し，糖脂質の動体解析を行なった．ドリコールに対し，蛍光基修飾マンノースリン酸を複合化し，細胞外に添加することで，小胞体へと輸送されることを見出し，現在，代謝的な取り込みを検討中である．
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| Strategy for Future Research Activity |
N-グリカンの機能解析を実行するためにはタンパク質との複合化が鍵になる．そのために，合成したN-グリカンを生細胞系へ代謝的に取り込ませることで，その機能評価を目指す．本研究課題では，i）合成糖鎖とドリコールの連結による糖転移前駆体の合成，ii）糖転移前駆体の生細胞系への取り込みおよび合成糖鎖の機能解析を行う．本研究では，合成したN-グリカンの還元末端に対しリン酸化後，糖鎖のキャリア脂質であるドリコールと連結し，糖転移前駆体への誘導を検討する．この糖脂質は糖転移酵素の認識基質であるため，酵素反応によって合成糖鎖をペプチドのアスパラギン残基へ転移させる酵素活性を評価する．その後，酵素反応によって得られる糖ペプチドについて， N-グリカンの修飾と耐熱性との関係性を明らかにする．また，共同研究者の跡見らは糖鎖生合成遺伝子をKOし，T. kodakarensisからN-グリカンを除去できることを見出している． N-グリカン欠損T. kodakarensisに対し，合成した糖転移前駆体の細胞膜への取り込みを検討し，合成糖鎖を取り込ませた細胞で高温における生存率や増殖率を評価する．本N-グリカンは，多分枝で，リン酸基を有し，アセチル化アミノ糖が多く含まれている．分枝数やアニオン性は広い水和領域の確保，アセトアミドはタンパク質との水素結合によるコンフォメーションの規定に役立っていると予想できる．そこで，天然のN-グリカン構造からから分枝糖やリン酸，アセトアミドを除いたN-グリカンを利用した構造活性相関研究により，糖鎖の構造と機能を結びつける．また，アジド標識糖鎖とクリックケミストリーにより， N-グリカンの導入位置の同定を行い， N-グリカンによるタンパク質の高次構造への安定性寄与を調べる．
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Research Products
(3 results)
