2021 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノム編集を基軸とした巨大酵素の機能解析とエンジニアリング
| Project/Area Number |
20J20880
|
|---|
| Research Institution | Hokkaido University |
|---|
Principal Investigator |
瀧野 純矢 北海道大学, 大学院総合化学院, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-24 – 2023-03-31
|
| Keywords | 天然物化学 / 有機化学 / 生合成 / ポリケタイド / 麹菌異種発現 / ゲノム編集 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本課題は、ゲノム編集を基軸とした巨大酵素の機能解析とエンジニアリングを目的として研究を進めている。具体的には、1)ゲノム編集を用いた麹菌異種発現系の拡張、2)糸状菌由来還元型ポリケタイド合成酵素 (HR-PKS)の機能解析、3)巨大酵素のエンジニアリングによるドメイン間の相互作用およびアミノ酸配列と機能の関係性の解明を目指す。
昨年度までに、約8 kbのHR-PKSを含むphialotide生合成遺伝子を麹菌ホットスポットへ一挙導入することで、ポリケタイド骨格異種生産および生合成経路解明を達成した(目的1)。また、phomenoic acid生合成遺伝子クラスターについても、同様の異種発現に成功した。
本年度は、ポリヒドロキシポリケタイドであるphialotide、phomenoic acidの絶対立体配置の決定を行った。異種生産したポリケタイド骨格に対するオゾン分解と還元的処理によって、分解生成物を取得した。それぞれの分解生成物について標品を合成し、スペクトルを比較することで絶対立体配置を決定した。明らかにした絶対立体配置から、ポリヒドロキシポリケタイドにおける立体配置の規則が提唱された。次いで、糸状菌由来既知ポリケタイドの絶対立体配置を調べると、多くの天然物が提唱した規則に一致する立体配置を有していることがわかった。また、HR-PKSの分子系統解析を行うと、規則に一致するHR-PKSが系統樹上で広く分布していることがわかった。この結果より、提唱した規則が糸状菌HR-PKSに汎用的に適用できることが示された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本課題は、1)ゲノム編集を用いた麹菌異種発現系の拡張、2)糸状菌由来還元型ポリケタイド合成酵素 (HR-PKS)の機能解析、3)巨大酵素のエンジニアリングによるドメイン間の相互作用およびアミノ酸配列と機能の関係性の解明を目的としている。このうち、1)は昨年度にphialotide生合成遺伝子クラスターの一挙導入を行うことで達成した。2)については、導入遺伝子の組み合わせを変えることで、各遺伝子の機能解析を達成した。
本年度は、ポリケタイド骨格の絶対立体配置を決定することで、HR-PKSの立体制御の統一的理解を目指した。異種生産したポリケタイド骨格に対して、オゾン分解と還元的処理を行い、分解生成物を取得した。分解生成物に対応する標品を合成し、スペクトルを比較することでphialotideの絶対立体配置を決定した。同様の実験をphomenoic acidについても行った。明らかにした絶対立体配置から、HR-PKSの立体制御に規則が見出された。また、既知ポリケタイドの立体配置を調査すると、多くのポリケタイドが提唱した規則に一致する立体配置を有していることがわかった。この結果より、今回の研究によって糸状菌HR-PKSにおける普遍的立体配置制御則が示され、目的2) HR-PKSの機能解析が計画以上に進んだと言える。
現在は、PKSのエンジニアリングを目指して、PKSの機能を相補するtrans-ERの機能解析を進めている。組換えタンパク質と中間体アナログを用いた実験によって、目的3達成のきっかけを掴んでいる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は、PKSのエンジニアリングを目指したtrans-ERの機能制御を行う。trans-ERはポリケタイド鎖の伸長において、HR-PKSの機能を相補する酵素である。HR-PKSは機能単位が連結しているのに対し、trans-ERは単独の酵素として機能するため、エンジニアリングに適した研究対象であると考えられる。具体的には、phialotide、phomenoic acid生合成におけるtrans-ERを研究対象とした実験を行い、機能制御のメカニズム解明を通じて、両者の生合成系の自在な改変を目指す。現在までに、trans-ERの組換えタンパク質と想定される中間体アナログを用いた実験を行い、trans-ERが触媒できる還元反応の回数が、天然物の構造と対応していることを明らかにした。今後は、AlphaFold2を用いた構造解析などを用いて変異体を作製し、反応回数を決定するのに重要なアミノ酸残基の特定を目指す。次いで、特定した重要残基の変異を行い、還元反応回数の自在な制御を目指す。これによって、酸化度の異なる天然物アナログや、特定の位置のみ狙って還元した類縁体の創出につながる。また、lovastatin生合成などにおける機能解析済みtrans-ERについても該当箇所のアミノ酸を精査し、機能との対応をつけることで、アミノ酸配列とタンパク質の機能との相互作用を解明するための知見が得られると期待される。
|
