2021 Fiscal Year Annual Research Report
Novel cell-cell recognition machinery between normal and transformed cells mediated by mechanical stress
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20J20930
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
黒宮 敬介 京都大学, 大学院医学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞競合 / メカニカルストレス / カルシウム / TRPC1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの研究結果からがん変異細胞がその周囲を正常細胞に囲まれた際に、周囲の正常細胞と変異細胞との間で互いに生存を争う細胞競合現象が存在することが明らかになっている。その際周囲の正常細胞が変異細胞の存在を認識し正常細胞層から排除することが知られているが、正常細胞と変異細胞間の細胞間認識の分子メカニズムについてはほとんど明らかになっていない。これまでの本研究の結果から変異細胞の共培養した正常細胞側で機械刺激受容性カルシウムチャネルの一つであるTRPC1(Transient Receptor Potential Channel 1)を介して細胞内カルシウムの一過的な上昇（カルシウムスパーク）が高頻度に起こることが観察された。さらに正常細胞側でTRPC1をノックダウンすると細胞競合による周囲の変異細胞の排除効率が減少することが明らかになった。このことから変異細胞の周囲の正常細胞側で起きるカルシウムスパークが変異細胞の排除に寄与していることが分かった。
また下流として正常細胞で生じるカルシウムスパークがどのようにして変異細胞の排除を惹起しているのか、そのメカニズムについて調べた。先行研究から変異細胞の周囲の正常細胞での運動性の亢進が変異細胞の排除に寄与していることから、細胞の動きに着目した。その結果、変異細胞と正常細胞を共培養した際にはそれぞれの単独培養条件と比較して、正常細胞だけでなく周囲の変異細胞の動きも増加しており、上皮細胞層の流動性が増加していることが明らかになった。さらに正常細胞側でTRPC1をノックダウンすると正常細胞だけでなく周囲の変異細胞の動きも抑制されることが分かった。このことからRas変異細胞の周囲の正常細胞におけるカルシウムスパークが上皮細胞層の流動性を促進することで変異細胞の排除に寄与している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目標としては以下の３つを挙げている。一つ目が変異細胞の周囲の正常細胞で働くメカニカルストレスの解明である。前年度と引き続きいてTraction force microscopyを用いて正常細胞に働く力を解析したところ、正常細胞のみの場合と比較して変異細胞の周囲の正常細胞では細胞にかかる力が変化していることが明らかになった。また別の指標として正常細胞の細胞および核の形の変化を調べたところ、正常細胞のみの場合と比較して変異細胞の周囲の正常細胞では細胞とその核の形が有意に変化していることが明らかになった。
二つ目は細胞間認識機構が変異細胞の排除を誘起する分子メカニズムの解明ということで、正常細胞側で起こるカルシウムスパークによってどのようにして変異細胞の排除が促進されているのか、そのメカニズムについてはこれまで明らかになっていなかった。本年度は細胞の動きに着目することで細胞が動くことで変異細胞の排除が促進されているのではないかと考え細胞の動きを測定した。その結果、正常細胞と変異細胞の共培養条件下ではそれぞれの単独培養条件と比較して正常細胞だけでなく、周囲の変異細胞の動きも増加していることが明らかになった。さらに正常細胞側でTRPC1をノックダウンすると正常細胞だけでなく周囲の変異細胞の動きも抑制されることが分かった。このことから、正常細胞側のカルシウムスパークが正常細胞及び周囲の変異細胞の動きを促進させる、すなわち上皮細胞層の流動性を亢進することが明らかとなった。またこれらの動きが変異細胞の排除に重要である可能性を示唆する結果も得られた。
最後に３つ目は生体内での検証ということで、共同研究によりゼブラフィッシュの初期胚にRas変異細胞を少数誘導すると、周囲の正常細胞でカルシウムスパークが高頻度に観察されることが分かった。以上の結果から計画通りに研究が進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の方針として以下の２点の課題について、その解明を目指す。
一つ目はメカニカルストレスの上流を明らかにする。これまでの研究結果からRas変異細胞と共培養した正常細胞ではメカノセンシティブカルシウムチャネルであるTRPC1がカルシウムスパークの上流として明らかとなった。また最近のデータから共培養条件下における正常細胞側の膜張力を膜張力センサープローブを用いて測定したところ、単独培養条件と比較して膜張力が上昇していることが明らかになった。しかしながら細胞膜にどのような変化が生じて膜の張力が上昇するのかについては分かっていない。Ras変異細胞が周囲に存在することで正常細胞側の膜張力が変化することからRas細胞側での何らかの変化が関与しているのではないかと考えられるが、その分子メカニズムは未だ明らかになっていない。本年度は張力に関わるとされる様々な阻害剤等を試して膜張力を制御するタンパク質を同定し、それをノックダウンした際に張力が変化するのか確認することでその分子メカニズムを解明する。
２つ目はカルシウムスパークの機能について明らかにする。これまでの結果からカルシウムスパークが起こることで細胞の運動性が亢進することが明らかになっているが、その分子メカニズムについては明らかになっていない。一般的に細胞が移動する際にはミオシンの収縮、細胞突起、あるいはfocal adhesionの活性化等が関与することが知られている。そこでアクチンもしくはミオシンに蛍光タグをつけたタンパク質をCaMP細胞に発現させる細胞株を樹立することでタイムラプスイメージングにより実際にカルシウムスパークが発生した際のアクチンもしくはミオシンの変化をリアルタイムで解析する。さらにカルシウムスパークを抑制した際にその現象が抑制されるかについても調べることでカルシウムスパークのより詳細な機能を明らかにする。
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