2020 Fiscal Year Annual Research Report
一酸化窒素によるアミノ酸センサーＧＣＮ２活性化を介した神経細胞死惹起機構の解明
| Project/Area Number |
20J21060
|
|---|
| Research Institution | Okayama University |
|---|
Principal Investigator |
藤河 香奈 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-24 – 2023-03-31
|
| Keywords | 一酸化窒素 / S-ニトロシル化 / アミノ酸飢餓 / GCN2 / tRNA / アミノアシルtRNA合成酵素 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
高齢化が進む先進国では、神経変性疾患の罹患率が上昇しており、その根本治療法の開発が求められている。神経変性疾患発症に関与する分子の一つとして、加齢や環境ストレスにより産生促進される一酸化窒素(NO)が注目されている。しかし、NO産生酵素阻害薬により病態は改善されるものの、循環器などに副作用があり、開発は進まなかった。このことから現在では、神経細胞死に関与するNO標的因子を直接制御することが必要だと考えられている。
これまでにNOにより非古典的な小胞体ストレス応答経路が活性化すること、またそれにはGCN2が関与していることを明らかにしている。しかし、NOがどのようにGCN2を活性化しているか不明であった。本研究ではNO誘導性細胞死へのGCN２活性化の寄与とその機構の解明を目的とした。
まず、NO刺激下での非古典的な小胞体ストレス応答経路の活性化に対するGCN2阻害薬（GCN2-IN-1）の効果を検討した。その結果、NO処理した場合に誘導される細胞死が、GCN2-IN-1前処理により20％改善した。以上より、NO誘導性細胞死にはGCN2活性化が寄与している可能性が示唆された。
次に、NOがGCN2を活性化するメカニズムの解明に取り組んだ。当研究室で以前行ったS-ニトロシル化タンパク質の網羅解析の結果を参照したところ、GCN2上流因子の１つにNO標的タンパク質となる分子を発見した。そこで、特定したタンパク質についてS-ニトロシル化タンパク質特異的検出法であるビオチンスイッチ法により再検証した結果、NO標的タンパク質であることが判明した。今後は、GCN2上流タンパク質がS-ニトロシル化を受けることにより、その酵素活性が変化するか検証するため、酵素活性測定系の構築を行う。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度では、NOによるGCN2活性化を介した細胞死誘導とその機構解明に重点を置き研究に取り組んだ。
まず、前者に関しては、NO誘導性細胞死に対するGCN2活性化の寄与を薬理学的に検討した。具体的にはGCN2阻害薬であるGCN2-IN-1を使用し、クリスタルバイオレット法により、細胞生存率を測定した。その結果、NO誘導性細胞死はGCN2阻害薬により20％改善した。以上より、NO誘導性の細胞死にはGCN2活性化が関与している可能性が示された。
後者に関してはGCN2上流のNO標的因子を以前 当研究室で行ったS-ニトロシル化タンパク質網羅解析のデータを利用し、絞り込んだ。加えて、HEK293T細胞を用い、S-ニトロシル化タンパク質特異的検出法であるビオチンスイッチにより再度S-ニトロシル化を受けるタンパク質であることを確認した。現在は、同定したタンパク質がS-ニトロシル化を受けた結果、酵素活性に変化をきたすのかを検証するため、酵素活性測定系の構築に取り組んでいる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
当該年度ではNO誘導性の細胞死におけるGCN2の寄与を薬理学的に検討し、明らかにすることが出来た。また初期的な検討ではあるが、GCN2上流の因子の一種が、NOによる翻訳後修飾（S-ニトロシル化）を受けることを確かめている。このことから、S-ニトロシル化を受けたGCN2上流因子は活性が低下し、GCN2活性化に寄与していると予想された。これを確かめるため、現在GCN2上流因子の酵素活性測定系の構築を行っている。この系が構築でき次第、NO存在下でのGCN2上流因子の活性測定を行う。上記の活性測定の結果によって、以下２通りの推進方策を考えている。
１. NO存在下でGCN2上流因子の活性が低下している場合
NOにより、GCN2が活性化する原因は現在 見当をつけているタンパク質がS-ニトロシル化を受け活性が低下したことが原因であると予想される。このタンパク質のS-ニトロシル化の標的部位を変異（Ｃ→Ｓに置換）することで、活性が回復するか検証する。
2. NO存在下でGCN2上流因子の活性は変化していない、または上昇する場合
この場合、現在 見当をつけているタンパク質のS-ニトロシル化がGCN2活性化に関与していないことが推察される。よって、その他のGCN2上流のNO標的因子が存在すると予想される。現在、GCN2上流のNO標的因子の候補となり得るものをいくつか選定しているため、こちらの酵素活性にNOが影響を与えるか検討する予定である。
|
Research Products
(2 results)
