2020 Fiscal Year Annual Research Report
Screening for synthetic lethal partners of mutations in polycomb-related genes
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20J21190
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
海渡 智史 東京大学, 大学院医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| Keywords | 合成致死 / 血液腫瘍 / EZH2 / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まずポリコーム群複合体関連遺伝子の中で、比較的高頻度に血液腫瘍において認められるEZH2の機能喪失型変異に着目し、合成致死誘導遺伝子の探索を行った。Cas9を導入した白血病細胞株K562を用いEZH2の機能喪失型変異株を樹立し、sgRNAレンチウイルスライブラリーによるゲノムワイドスクリーニングを行った。いくつかの合成致死誘導遺伝子の候補が挙がったが、これらの遺伝子に対し個別にsgRNAを作成しノックアウトの効果を検証してもスクリーニングの結果が再現されなかった。各細胞株におけるCas9活性の検証や、レンチウイルスライブラリーの細胞株に対する感染効率の調整を要すると考えられた。
そこでCD45に対するsgRNAにより各細胞株におけるCas9活性を評価し、さらに蛍光色素を有するsgRNAレンチウイルスライブラリーに変更し、感染効率を正確に評価しながらCRISPR/Cas9スクリーニングを行った。その結果、いくつかのEZH2機能喪失型変異に対する合成致死候補遺伝子を得た。また、MOLM-13やMDS-Lといった骨髄異形成症候群患者に由来する細胞株においても同様のスクリーニングを行い、細胞増殖に関わる遺伝子や薬剤耐性・感受性に関わる遺伝子の候補を複数同定した。
小規模なライブラリーに変更したため探索範囲が狭まった一方で、いくつかの遺伝子に対して個別に設計したsgRNAを導入するとスクリーニングと同様の結果が得られることが確認され、再現性の高いデータが得られたと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Cas9を発現させた白血病細胞株K562細胞株に、EZH2に対するsgRNAを導入しEZH2機能喪失型変異を有する細胞株を樹立した。ヒストンH3K27におけるトリメチル化をウエスタンブロット法で評価し、EZH2変異株におけるトリメチル化が低下していることを確認した。これらの細胞株をsgRNAレンチウイルスライブラリーに感染させ、培養前後でのsgRNAの割合を比較してEZH2機能喪失型変異に対する合成致死遺伝子の候補を絞り込んだ。しかし、個別にこれらの候補遺伝子をノックアウトしても再現性が得られなかった。スクリーニングの結果が再現されない要因として、各細胞株におけるCas9活性の低下や、予想された以上の感染効率による多重感染等が考えられた。
これらの問題点を解決するために、まず薬剤選択によりCas9発現細胞のみを再度濃縮した。これらの細胞株にCD45に対するsgRNAを導入し、CD45の発現が低下することでCas9活性が保たれていることを確認した。さらに、エピジェネティクス関連遺伝子を主なターゲットとした、蛍光色素により感染効率が評価可能な小規模なsgRNAレンチウイルスライブラリーを用いて再度スクリーニングを行った。その結果、いくつかのEZH2機能喪失型変異に対する合成致死候補遺伝子を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
MOLM-13やMDS-Lといった骨髄異形成症候群（MDS）患者由来の細胞株に対してもCas9を導入し、同様のエピジェネティクス関連遺伝子を主要なターゲットとしたライブラリーを用いてスクリーニングを行った。いくつかの遺伝子に対するsgRNAが2つのセルラインに共通して培養後に減少し、MDSにおける治療標的候補として考えられた。これらの知見は個別に候補遺伝子をノックアウトすることで再現された。加えて、MDSに対する治療薬である脱メチル化剤（デシタビン、アザシチジン）の存在下でのスクリーニングを行い、薬剤抵抗性に関わる遺伝子や感受性を亢進させる遺伝子の候補をいくつか同定した。現在これらについて更なる検証を行っている。
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Research Products
(2 results)
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[Journal Article] DHODH inhibition synergizes with DNA-demethylating agents in the treatment of myelodysplastic syndromes2021
Author(s)
Kayamori K, Nagai Y, Zhong C, Kaito S, Shinoda D, Koide S, Kuribayashi W, Oshima M, Nakajima-Takagi Y, Yamashita M, Mimura N, Becker HJ, Izawa K, Yamazaki S, Iwano S, Miyawaki A, Ito R, Tohyama K, Lennox W, Sheedy J, Weetall M, Sakaida E, Yokote K, Iwama A
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Journal Title
Blood Advances
Volume: 5
Pages: 438-450
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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