2020 Fiscal Year Annual Research Report
Clp1の分子進化を模倣した人工キメラClp1の機能検証
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20J21288
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
齋藤 元文 慶應義塾大学, 政策・メディア研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| Keywords | 核酸リン酸化酵素 / 原生生物Clp1 / タンパク質ドメイン / 遺伝子重複 / 分子進化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
RNA鎖の5' 末端をリン酸化する酵素であるClp1の機能破綻は, 神経変性病を引き起こし, 生体内でも重要な役割を担っている. この真核生物のClp1は, 主にリン酸化に関与するポリヌクレオチドキナーゼ (PNK)ドメインの両側に, N末端ドメインとC末端ドメインを含む3つのタンパク質ドメインによって構成されている. 一方, 我々は原核生物のアーキアやバクテリアのClp1は, 主にPNKドメインから構成されうる単純な構造で, RNAのみならずDNAもリン酸化することを見出した. しかしながら, この広範な種に保存されたClp1遺伝子がどのように分子進化を遂げ, リン酸化の基質特異性を獲得してきたのか明らかとなっていない. そこで本研究では, 古細菌と高等真核生物の中間に位置している原生生物を含む, 真核生物の完全長ゲノムからClp1ファミリー遺伝子を取得し, その網羅的なタンパク質ドメイン構造の比較解析や分子進化解析を行った. その結果, 主要な真核生物のClp1では, 前述した3つのタンパク質ドメインによって構成されたが, 原生生物のAlveolata や Euglenozoaでは, PNKドメインまたは, N末端ドメインとPNKドメインの2つのタンパク質ドメインから構成されうる中間型のClp1様遺伝子であることが予測された. 今後は, 特殊なドメイン構造を有している原生生物Clp1様遺伝子のリン酸化活性とその基質特異性を調べるために, 組換え体タンパク質を用いて検証していく. 採用1年目は, 3種の原生生物Clp1組換え体タンパク質の精製までを行った. その結果, 原生生物の組換え体Clp1タンパク質を作成することができ, ウェスタンブロッティングでの確認に成功している.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
情報学的解析では, Clp1ファミリータンパク質を網羅的に収集するために, 代表的な真核生物の完全長ゲノムが登録されたRefSeq (2020年9月時点)に対して配列類似性検索を行い, 1,264配列のClp1ファミリータンパク質を取得した. これらは, 代表的な真核生物の約97.8% (358種中350種)に存在しており, 真核生物の初期にあたる原生生物のAlveolata (31種中21種; 84%), Euglenozoa (8種中8種; 100%)にも存在していることが明らかとなった. 次に本研究では, この予測された原生生物のClp1様遺伝子が分子進化系統樹上でどの位置に分類されるのか調べるために, 配列類似性に基づく分子進化系統樹を作成した. その結果, 原生生物のClp1様遺伝子は, 真核生物のClp1分子進化系統樹の初期段階に位置しており, 遺伝子重複によって多様化していた. 次に, 原生生物のClp1様タンパク質が進化過程で特徴的な機能ドメインを獲得しているのか調べるために, 既知のPfamドメインデータベースに対して網羅的なドメイン解析を行った. Clp1グループでは, これまで報告されている3つのドメイン構造 (N末端ドメイン, PNKドメイン, C末端ドメイン) によって構成されているのに対して, 原生生物のClp1様タンパク質はPNKドメイン, または, N末端ドメインとPNKドメインによって構成されうる中間型のClp1であることが明らかとなった. 今後, 情報学的解析で予測された特殊なドメイン構造を有している原生生物Clp1のリン酸化活性とその基質特異性を調べるために, 現在, 組換え体タンパク質を作成し, 精製の条件検討を行っている段階である.
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| Strategy for Future Research Activity |
原核生物から真核生物に進化するClp1分子の様相を捉えるために, 大規模な分子進化解析を行い, 原生生物にもClp1様遺伝子が存在することを予測した. さらに, そのタンパク質ドメイン構造は, 原核生物から真核生物に進化する中間体の構造を有していた. そのため, 本年度では, 情報学的解析と実験学的検証の2点について研究を進めていく.
情報学的解析においては, 中間体の構造を有している原生生物のClp1様遺伝子に関して, リン酸化活性に重要なモチーフが保存されているのかアミノ酸配列の比較解析を行う. さらに, 大規模な系統解析を行うことで, 原生生物Clp1様遺伝子の多様性の解明に迫りたいと考えている.
実験学的検証としては, 3種の原生生物のClp1様遺伝子に関して, リン酸化活性の基質特異性について検証していく. そのために, 原生生物のClp1様遺伝子の高品質な大腸菌組換え体タンパク質の作成および精製を行う. その後, 精製された原生生物のClp1組換え体タンパク質と, 同様の手法で作成した真核生物と原核生物のClp1を使ってRNAやDNAに対するリン酸化活性を検証し, 基質特異性がタンパク質ドメインの獲得によってどのように変化するのか明らかにしていく. また, 原核生物のThermus scotoductus Clp1に関して, 我々の研究でRNAやDNAに対して, リン酸化活性があることを証明したが, このバクテリアの生体内で, どの因子を標的としてリン酸化しているのか明らかとなっていない. 本研究では, Thermus scotoductusの培養液から, Clp1に相互作用するRNAとタンパク質を同定し, 生体内における機能の観点からも, 原核生物と真核生物の差異を比較していきたい.
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