根粒菌共生アイランドの動的構造の解明：宿主を騙す根粒菌の生成機構とその意義

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20J21412
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 嵐田 遥 東北大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2020-04-24 – 2023-03-31
• Keywords: Cheating根粒菌 / ミヤコグサ / PINK4 / IS

Outline of Annual Research Achievements

採択者は一昨年度、ダイズ根粒菌Bradyrhizobium diazoefficiens USDA122株の液体培養下で、共生アイランドに散在する同種・同方向のIS間の相同組換えにより、IS間の窒素固定遺伝子群nifが一定頻度で欠失する現象を見出した。単離株は、接種試験で根粒を形成するものの窒素固定活性は検出されず、近年その存在が議論されているCheating根粒菌であった。一方マメ科植物では、共生関係成立後にCheating根粒菌を排除したり、窒素固定を行う根粒菌を大量に根粒中で増殖させて土壌中に放出させる仕組みを持つことが知られている。そのため根粒からのCheating根粒菌の単離は困難であり、その実態は不明であった。採択者は自身の研究成果より、ISを介したCheating根粒菌の生成に着目し、その生成機構の解明を進めた。さらに受入先の研究班では、Cheating根粒菌への制裁機構を失ったミヤコグサ変異体(pink4)を利用し、自然土壌から、同じ系統に対して表現型が異なるCheating根粒菌4株を分離していた。これを受け採択者は、自然条件におけるCheating根粒菌の多様性と宿主のCheating根粒菌排除機構の解明に着手した。単離されたCheating根粒菌が宿主に示す表現型、各株にPINK4による制裁機構が働いているか明らかにするため、野生型とPINK4変異体への接種実験を行ったところ、宿主に示す窒素固定能が株間で異なり、4株中3株の接種体で、異なる根粒生長段階におけるPINK4による根粒発達の抑制が示唆された。そこで、細胞内共生成立後の表現型が異なるミヤコグサ系統と根粒菌の組み合わせを用いてトランスクリプトーム解析を行った。マメ科植物の共生関係成立後の根粒菌選別機構を解明し、根粒菌叢にどのような影響を与えているのか評価中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

採択者はIS介在型欠失の生成機構を解明したと同時に、宿主側にも視野を広げCheating根粒菌の制裁機構の解明まで着手することができたことから、概ね順調に進展していると判断した。研究成果については以下の通りである。一昨年度の成果より、ISRj1, ISRj2介在型欠失が偏って検出されたUSDA122株のRj2型ダイズ接種実験時に比べ、液体培養下ではより多様なIS介在型欠失であり、その多数が根粒形成遺伝子群nodVWを含むISBj12介在型欠失であった。この欠失型の相違の原因を探るため、ISRj1及びISBj12介在型欠失株のRj2ダイズへの共接種試験を行い、栽培後の根粒から1植物体における各株の占有率を調査したところ、ISRj1介在型欠失株が全根粒で検出され、ISBj12介在型欠失株由来の根粒は非検出であった。したがって、Rj2型ダイズ接種による検出系ではnodVWを残した一部のIS介在型欠失のみが検出されており、本来は培養中で多様なISを介したnif欠失が確率的に生じることが示唆された。同時に、4株のCheating根粒菌単離株とそのPINK4制裁機構を明らかにするため、接種体の表現型解析を行った。その結果、宿主に示す窒素固定能が株間で異なり、3株の接種体で異なる根粒の生長段階でPINK4により根粒の発達が抑制されたことを明らかにした。現在、共生成立後の表現型が異なるミヤコグサ系統と根粒菌の組み合わせのトランスクリプトームデータを元にPINK4制裁機構の網羅的な解明にも着手している。またPINK4制裁機構が根粒菌叢を変化させる影響を評価するため、野生型、PINK4変異体に対してCheating根粒菌と優良根粒菌の共接種実験を行い、窒素固定活性測定や根粒の形質を解析したところ、2株を等量接種した植物体では、優良根粒菌由来根粒のみが発達している傾向が認められた。

Strategy for Future Research Activity

Cheating根粒菌4株が根粒中でPINK4による制裁を受けているか明らかにするため、蛍光タンパク質を標識した鹿島台Cheating根粒菌4株を野生型ミヤコグサMG20とそのPINK4変異体に接種・栽培し、根粒中の蛍光観察を行う。この時、栽培4週間内で複数回のサンプリングを行い、経時的な蛍光観察を行うことで、制裁が起こるタイミングも考察する。また、地上部が枯れた後の爆発的な増殖の有無にもPINK4が関係するか考察するため、地上部切除後3日目の根粒の蛍光観察も行う。さらに、各株とミヤコグサ系統の組み合わせにより形成された根粒を含む根から抽出したRNAサンプルを用いてトランスクリプトームデータを収集したため現在解析を進めている。PINK4遺伝子と関連遺伝子の発現パターンから、細胞内共生成立後の制裁機構に関わる分子メカニズムを考察する予定である。一方、これまで単離したCheating根粒菌4株の原因変異を特定し、自然界のCheating根粒菌の生成機構を明らかにするため、MAFF303099アミノ酸配列をクエリーに、Cheating根粒菌3株、参照株としてMesorhizobium 分離株9株(Bamba et al 2020)のアミノ酸配列をデータベースとしてblastp解析を行い、共生アイランド内の各タンパク質の充足率を算出した。これより、株間で充足率を比較することで変異遺伝子候補を探索する。また、PINK4によるCheating根粒菌由来の根粒の発達抑制と優良根粒菌の感染効率の上昇により、PINK4が土壌の根粒菌叢の変化に関係する可能性が示唆されたことから、MG20、PINK4変異体のMAFF株、Cheating根粒菌の共接種後、長期栽培における表現型も解析する。これにより、PINK4が宿主の生育に果たす役割や、土壌の根粒菌叢の変化に関わる可能性を考察する。