マウス原腸胚の三胚葉形成において遺伝子発現を制御するクロマチン構造変化の解明

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20J21746
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 鈴木 颯 筑波大学, 人間総合科学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2020-04-24 – 2023-03-31
• Keywords: 原腸胚 / 三胚葉 / レポーターマウス / FACS / ATAC-seq / RNA-seq / ゲノム編集 / ノックアウトマウス

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、3つの課題に取り組んでいる。以下に令和２年度の研究実施状況を示す。
1.三胚葉形成において各胚葉で特異的なオープンクロマチン領域の探索：各胚葉で特異的なオープンクロマチン領域を探索するためには、1匹のマウス胚から各胚葉の細胞をそれぞれ分取しなければならないが、野生型マウス胚から各胚葉の細胞を分取するのは技術的に困難である。そこで、申請者が作製した三胚葉可視化レポーターマウスから胎齢7.5日胚を回収し、トリプシン処理による細胞分離後、胚葉特異的なレポータータンパク質の蛍光を用いたFluorescence Activated Cell Sorter（FACS）により各胚葉の細胞集団を分取する方法を確立した。
2.各胚葉の特異的オープンクロマチン領域と遺伝子発現との相関の解析：1.で確立した方法でFACSにより分取した内胚葉の細胞細胞集団を用いて、最適な細胞数、mRNA精製の条件を検討し、DNA分析用マイクロチップ電気泳動装置で品質チェックを行うことで、RNA-seq用のcDNAライブラリーを作成することに成功した。また、作製したcDNAライブラリーを用いた次世代シーケンス解析まで進んだ。
3.オープンクロマチン領域の破壊による胚葉形成異常の確認：1.と2.の結果から、発現量の高い遺伝子の周囲に存在するオープンクロマチン領域を同定しゲノム編集により破壊する予定であるが、当初計画していた受精卵内での領域破壊では、意図しない変異やモザイクの可能性を除けない。一方、ES細胞内のゲノム編集では、個体化前の遺伝型解析により上記の懸念点が解消される。そのため、今年度は三胚葉可視化レポーターマウスからES細胞を樹立した。また、樹立した三胚葉可視化マウスES細胞の遺伝子破壊の検討、および樹立したES細胞由来のマウス原腸胚作製の検討を終えている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初予定していたオープンクロマチン領域および遺伝子発現の解析まで進まなかったため、やや遅れていると評価した。課題1と2について、各胚葉の細胞の分取までは順調に進んだが、次世代シーケンス解析まで進まなかった。しかし、課題3については、当初の計画で予定してた受精卵内でのゲノム編集による懸念点を取り除くために、ES細胞内でのゲノム編集に切り替えることができたため、次年度以降の解析を促進させることができると考えている。

Strategy for Future Research Activity

以下に、各課題の今後の推進方策を示す。
1.三胚葉形成において各胚葉で特異的なオープンクロマチン領域の探索： FACSで分取した細胞からクロマチンを含めた核DNA を回収・精製し、網羅的オープンクロマチン領域の解析が可能なAssay for Transposase-Accessible Chromatin Sequencing（ATAC-seq）用のDNAライブラリー作製の条件検討を行う予定である。また、方法が確立できたら次世代シーケンス解析を行う。
2.各胚葉の特異的オープンクロマチン領域と遺伝子発現との相関の解析：次世代シーケンス解析の結果を基に、今回確立した方法で作製したcDNAライブラリーのクオリティを評価していく。さらに、必要があれば作製方法を改善していく。また、外胚葉や中胚葉においても同様の方法でcDNAライブラリーを作製し、次世代シーケンス解析を行う予定である。
3.オープンクロマチン領域の破壊による胚葉形成異常の確認：オープンクロマチン領域を破壊したES細胞の樹立と、そのES細胞を用いたマウス原腸胚作製を行う予定である。