クライオ電子顕微鏡を用いたClass B GPCRの単粒子構造解析

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20J21820
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 小林 和弘 東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2020-04-24 – 2023-03-31
• Keywords: GPCR / 単粒子構造解析 / クライオ電顕 / 慢性疾患

Outline of Annual Research Achievements

本年度は研究標的の一つであるPTH1受容体について、内在性作動薬であるPTHの結合したPTH1受容体とGsタンパク質のシグナル伝達複合体の構造を明らかにし、PTHが受容体の活性化時間を制御するメカニズムを明らかにした。代表者はPTHがどのようにPTH1受容体を活性化状態に維持しているのかを明らかにするため、クライオ電子顕微鏡を用いてPTH-PTH1受容体-Gsタンパク質複合体の高分解能立体構造を明らかにし、その試料中において5つの異なる構造状態を決定した。これらの構造では受容体の膜貫通部位は剛直な構造を取る一方で、作動薬であるPTHとそれを結合させた細胞外のドメインが大きく構造変化しており、細胞外の領域は運動性が高いことが示唆された。これらの構造から、運動性の高いこの領域において、分子運動によりPTHが2次構造を崩す際に特定の構造状態をとる可能性が示唆された。その構造変化の持つ意味と再現性について、分子動力学シミュレーションを用いて検証し、リガンドの構造が崩れることにより、受容体が不活性化することを明らかにした。
また、本年度は研究計画における3年目の課題である内在性リガンドPTHrPの結合したPTH1RとGsタンパク質のシグナル伝達複合体の立体構造も明らかにした。PTHrPは結合時間が極めて短いため、PTHrP-PTH1R-Gs複合体として精製する過程で一部が解離し高純度でのシグナル伝達複合体の精製が困難であった。そこで、代表者は新規の精製系を構築し、精製から溶液を凍結し画像解析するまでの時間を短縮することに成功し、これにより、解離の早いリガンドの構造解析が可能となった。このPTH結合型PTH1受容体とPTHrP結合型受容体の構造を比較することにより、受容体の疎水性ポケットに対する結合性の違いを見出し、変異体機能解析を用いて受容体の活性化時間を制御する様式を明らかにした。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本年度は研究計画における3年目の課題である内在性リガンドPTHrPの結合したPTH1RとGsタンパク質の複合体の立体構造も明らかにしているため。PTHrPは結合時間が極めて短いため、PTHrP-PTH1R-Gs複合体として精製する過程で一部が解離し画像解析が困難であったが、精製時における各タンパク質の濃度検討に加え、新規精製系の構築により純粋なPTHrP-PTH1R-Gs複合体のみを高純度で得ることに成功した。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究としては、さらなる変異体機能解析や分子動力学シミュレーションを行うことでPTH1受容体を介した作動メカニズムについて詳細に明らかにしていく予定である。