2021 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of a novel serum diagnosis method for flaviviruses based on binding profiles of anti-flavivirus antibodies
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20J22269
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
田畑 耕史郎 北海道大学, 国際感染症学院, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| Keywords | フラビウイルス感染症 / 抗体 / 交叉反応 / 血清診断 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題「抗フラビウイルス抗体の結合プロファイルを用いたフラビウイルスの血清診断法の確立」では、交叉反応性を含めた抗フラビウイルス抗体の結合活性を網羅的に評価することにより、ウイルス感染によって誘導される特徴的な抗体の結合プロファイルを見出し、これまでに感染歴のあるフラビウイルス種を特定することが可能な新規血清診断法の確立を目的としている。当該年度は、抗フラビウイルス抗体の結合プロファイル取得のためのウイルス抗原パネルの作製、及び作出した抗原パネルに対する標準感染血清の結合プロファイルを取得することを計画した。
フラビウイルスタンパク質において、ウイルス種特異性が高いエピトープとして知られている二量体エンベロープタンパク質（Edimer）をウイルス抗原として使用するため、組換えタンパク質としての作出を試みてきた。これまでの検討により、Edimerは不安的なタンパク質であることから、作製および精製の過程で大部分が凝集してしまうことが明らかになった。
フラビウイルスが感染した細胞から出芽までの過程で、pH依存的に粒子構造を変化させ、宿主のプロテアーゼであるフーリンによってエンベロープ前駆体タンパク質とエンベロープタンパク質（E）が消化されることにより、ウイルス粒子の成熟が進む。消化されたEはウイルス粒子上で、Edimerとして存在することが知られている。しかしながら、感染細胞から出芽するフラビウイルス粒子は部分的に成熟が進んだ未成熟粒子であることが示されている。そこで、精製したウイルス粒子をin vitroのフーリン消化実験を実施することにより、完全に成熟が進んだウイルス粒子を作出し、これを抗体検出抗原として用いることとした。
当該年度以降は、完全成熟フラビウイルス粒子作出のための条件検討、また、標準感染血清を用いて完全成熟ウイルス粒子の抗体検出抗原としての有用性の評価を実施する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究課題では、当初、昆虫特異的フラビウイルス（ISFV）を基本骨格として、一部を蚊媒介性の病原性フラビウイルス（MBFV）に置換したキメラウイルス様粒子を作出し、それを抗体検出抗原とすることを計画していた。ISFVは哺乳類動物に感染性を示さないことから、置換したMBFVに対する抗体のみを検出することできることが期待された。しかしながら、ISFVとMBFVの抗原の類似性に関する報告は限定的であり、未だ不明な点も多い。そこで、当該年度は、抗フラビウイルス抗体の結合プロファイル取得のためのウイルス抗原パネルの作製、及びISFVとMBFVの抗原類似性を明らかにすることを目的に研究課題に取り組んだ。
抗原パネルの作製は、ウイルス種特異的なエピトープである二量体エンベロープタンパク質（Edimer）の作製を試みた。その結果、組換えEdimerは不安定なタンパク質であり、作製及び精製する過程で大部分が凝集してしまうことが明らかになった。そこで、Edimerをウイルス粒子上に保有する完全成熟フラビウイルス粒子の作出を目指した。現在、完全成熟粒子を作出のための条件検討を実施しており、これによりEdimerを保有したウイルス粒子の安定的な供給が期待される。
さらにISFVであるPsorophora flavivirus（PSFV）とBarkedji virus（BJV）に対する抗血清を作出し、各種MBFVに対する結合活性や中和活性、抗体依存性感染増強活性を評価することで、ISFVとMBFV間の抗原類似性を評価した。その結果、ISFVとMBFVは、類似した構造タンパク質を有していることが示唆された。本研究成果は、論文とし投稿準備中である。
来年度に繋がる成果を得られたこと、更に、フラビウイルスの抗原性について新たな知見が得られたことから、「当初の計画以上に進展している。」と評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当該年度で得られた成果を基に、次年度はウイルス粒子上にウイルス種特異的なエピトープであるE dimerを保有する完全成熟ウイルス粒子を用いて、マウス標準感染血清を用いた抗体の網羅的な結合活性の評価を実施する。その結果から各フラビウイルス感染における特徴的な結合パターンを見出す。続いて、本研究所が有しているザンビア拠点との共同研究でヒト検体を用いた結合活性の評価を実施し、血清診断への応用の可能性について検討する。しかしながら、現在海外渡航が困難な状況であるため、対象とするフラビウイルス種の幅を広げるなど、日本においても検討が可能なウイルス抗原パネルの検討についても実施することを計画している。
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