2021 Fiscal Year Annual Research Report
One-step purification and functional analysis of the chloroplast ATP synthase complex
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20J22917
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
秋山 健太郎 東京工業大学, 生命理工学院, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| Keywords | ATP合成酵素 / レドックス制御 / クラミドモナス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ATP合成酵素は、ミトコンドリア内膜や葉緑体チラコイド膜上に存在し、電子伝達系によって形成された膜内外のプロトン電気化学ポテンシャル差を駆動力として軸を回転させながら、生体内のエネルギー代謝に普遍的に用いられるATPを合成している。葉緑体ATP合成酵素は、細胞内酸化還元状態に応じて活性が制御される「レドックス制御」を受けていることが特徴的である。葉緑体内の酸化還元状態は光合成が駆動するときに還元的になり、夜間は酸化的になる。したがって、葉緑体ATP合成酵素のレドックス制御は光合成条件に適応した効率の良いATP生産に関与するものと考えられている。本研究課題では、単細胞緑藻であるクラミドモナス由来の葉緑体ATP合成酵素を完全複合体として精製し、ATP合成活性を評価する実験系を確立して、最終的には、そのレドックス制御機構を解明することを目的としている。本年度は以下の研究を行なった。
① 変異株のレドックス応答の評価
昨年度に作出したレドックス応答に関係すると予想されている部分に変異を導入したクラミドモナス変異株を用いて、葉緑体ATP合成酵素のレドックス状態の明暗応答を調べた。その結果、これまでこの酵素のレドックス応答に重要とされてきたアミノ酸を置換あるいは欠損させても、レドックス応答が起きることが明らかになった。
② 変異型葉緑体ATP合成酵素の精製
これまでに作出したATP合成酵素のレドックス制御および応答に関連する変異株と、精製用タグを付加したATP合成酵素を持つ株を交配することで、変異型葉緑体ATP合成酵素の精製が可能なクラミドモナス株の作出に取り組んだ。その結果、当初目標としたレドックス制御および応答に関連する変異と精製用タグの両方を持つATP合成酵素を持ったクラミドモナス株を作出することに成功した。また、それらのクラミドモナス株を用いることで、変異型酵素を精製することもできた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
① 変異株のレドックス応答の評価
レドックス応答に関する変異の研究結果は、これまで予想されてきた葉緑体ATP合成酵素のレドックス応答機構を見直す必要があることを示唆するものであった。今後、制御に関わる分子構造についてより詳細な研究を行うことで、この酵素のレドックス応答機構を分子レベルで理解する新たな知見が得られれるものと期待している。
② 変異型葉緑体ATP合成酵素の精製
本研究課題を通して作出したクラミドモナス株を交配することによって、葉緑体ATP合成酵素のレドックス制御の仕組みを理解するために重要な変異体酵素完全複合体の精製が可能になった。今後、この酵素複合体を用いた生化学および構造生物学的解析を行うことで、ATP合成酵素のレドックス制御機構を分子レベルで解明することに大きく貢献するものと期待している。
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| Strategy for Future Research Activity |
① 変異型葉緑体ATP合成酵素の生化学的解析
昨年度に精製した変異型葉緑体ATP合成酵素の生化学的な解析を行い、酵素に導入した変異と活性制御の関係を明らかにする。
② 葉緑体ATP合成酵素の構造解析
昨年度に作出した野生型および変異型葉緑体ATP合成酵素の構造を、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析によって明らかにすることで、分子構造と活性制御の関係を明らかにする。
上記の①と②によって、葉緑体ATP合成酵素のレドックス制御機構を分子レベルでモデル化する。
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