2021 Fiscal Year Annual Research Report

Clarification of PD-L1 functions under genotixic stress

Research Project

Project/Area Number	20J40010
Research Institution	St. Marianna University School of Medicine
Principal Investigator	仁平直江聖マリアンナ医科大学, 医学研究科, 特別研究員(RPD) (40589470)
Project Period (FY)	2020-04-24 – 2024-03-31
Keywords	DNA損傷 / PD-L1
Outline of Annual Research Achievements	生体内において癌細胞は免疫寛容能を獲得することで、免疫系による排除機構から回避し増殖を繰り返す。免疫チェックポイント分子PD-L1は多くの癌細胞で高発現が報告されており、T細胞などの免疫細胞に発現するPD-1と結合することで免疫細胞の不活化や増殖抑制を促す。これまでのPD-L1研究では、細胞表面に発現する“PD-1のリガンド”としての機能が注目され、発現制御に関する研究が進められてきた。一方で我々は、PD-L1が細胞膜上だけでなく核内にも局在するという知見を見出し、その分子制御機構を明らかにした。そして、PD-L1が核内にて炎症や免疫応答などに関わる遺伝子の転写制御に関与していることをNature Cell Biology誌に発表した。これらの研究成果よりPD-L1の核内での機能の一端は明らかにすることができたが、PD-L1の核内での機能はまだあまりよくわかっていない。そこで令和3年度は、PD-L1と結合するいくつかのDNA損傷応答因子に着目し、DNA損傷応答におけるPD-L1の機能解析を行った。そして、トリプルネガティブ乳癌細胞MDA-MB-231細胞やBT-549細胞を用いた解析より、内在性PD-L1の欠失によって抗癌剤アドリアマイシンやエトポシド、放射線などのDNA損傷刺激によって引き起こされるCHK1のリン酸化が低下することを見出した。CHK1はATRの基質であることから、PD-L1はATRによるCHK1のリン酸化を制御することでDNA損傷のシグナル伝達に寄与していることが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 令和3年度はPD-L1の新たな機能として、DNA損傷応答への関連性を示唆する結果が得られた。DNA傷害性抗がん剤はPD-L1の転写を誘導することが知られていたが、DNA損傷後のPD-L1の機能はあまりわかっていなかったことから、PD-L1の生理機能の解明という観点では大きな発見と思われる。また、これらの解析は申請書作成時の研究計画に沿って行うことができていた。次年度は、DNA損傷シグナル応答におけるPD-L1の機能の生物学的意義について解析を行う。
Strategy for Future Research Activity	昨年度までの研究結果より、PD-L1はATRによるCHK1のリン酸化を制御することでDNA損傷のシグナル伝達に寄与していることが示唆された。そこで令和4年度は、「CHK1のリン酸化の分子制御機構の解明」と「DNA損傷下におけるPD-L1の機能の生物学的意義の解明」に焦点を当て、以下の研究を進める。「CHK1のリン酸化の分子制御機構の解明」 PD-L1 がどのようにCHK1のリン酸化の制御に関与しているかを明らかにするために、ATRとCHK1に着目した生化学的解析を行う。PD-L1の発現の有無によるATRとCHK1の会合への影響について検証するために、免疫沈降法による解析を行う。PD-L1が発現している、トリプルネガティブ乳癌細胞（MDA-MB-231細胞やBT-549細胞）を解析に用いる。また、内在性のATRを用いたin vitroキナーゼアッセイを行い、ATRによるCHK1へのリン酸化能についてもPD-L1の有無で比較検討する。［DNA損傷下におけるPD-L1の機能の生物学的意義について］ ATRによるCHK1のリン酸化はDNA損傷によって惹起される細胞周期の停止やDNA修復、アポトーシス誘導に関与することが知られている。そこで、PD-L1がこれらのDNA損傷応答に関与しているかどうかについて、FACS解析や細胞生存アッセイ解析を行う。核内でのPD-L1の機能に着目して解析するための、核内移行できないPD-L1変異体を用いた解析や、PD-L1の核内移行を阻害するHDAC2阻害剤を用いた解析を行う。