動物初期胚において胚葉形成と発生運命決定をおこなう遺伝子発現調節システム

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20J40280
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 小林(徳岡) 三紀 京都大学, 理学研究科, 特別研究員(RPD)
• Project Period (FY): 2020-04-24 – 2023-03-31
• Keywords: 遺伝子発現調節 / 初期発生

Outline of Annual Research Achievements

ホヤ初期胚では、母性転写因子の働きにより、最初の胚性の遺伝子発現が16細胞期に起きる。32細胞期胚の遺伝子発現は、16細胞期に発現した調節因子（転写因子、シグナル分子）と母性因子によって調節されていると考えられる。そこで、16細胞期に発現する13個の調節因子と3個の母性因子を「上流因子」の候補とし、実験と遺伝子発現調節シミュレーションを繰り返して行ない、それぞれの下流遺伝子の発現に必要な上流因子の組み合わせを示す調節関数を決定した。また、上流因子の過剰発現実験を行い、得られた上流因子のセットがそれぞれの下流遺伝子の発現を引き起こすのに十分であるかを検証し、ほぼすべての下流遺伝子については十分性を確かめることが出来た。
一方、下流遺伝子のひとつであるNodalについては、発現に必要な上流因子のセットの候補を得ることはできたものの、得られたセットを用いた過剰発現実験において、Nodalの発現を引き起こすことができなかった。このことは、Nodalの発現には、得られた上流因子のセットだけでは不十分である可能性を示唆している。最近、Imaiら(Dev Biol. 458, 215-227 (2020))が初期胚におけるRNA-seq解析を行っており、16細胞期で胚性の発現を行う遺伝子が多数同定されている。私は、これらの遺伝子の中から新たな上流因子の候補を複数ピックアップし、Nodalの発現に必要な新たな上流因子の同定を試みた。その結果、現在得られている上流因子のセットにZF143 (FOG=Friend Of Gata)遺伝子を追加したセットがNodalの発現を引き起こすのに十分である可能性が高いというデータが得られた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

32細胞期から胚性の発現を開始する調節遺伝子の発現に必要な上流因子の組み合わせを示す調節関数を決定することができ、その結果を取りまとめた論文を投稿し、採録が決定した（Science Advances誌、4月採録が決定し、近日出版予定）。
一方、下流遺伝子のひとつであるNodalについては、発現に必要な上流因子のセットの候補を得ることはできたものの、得られたセットを用いた過剰発現実験において、Nodalの発現を引き起こすことができなかった。このことは、Nodalが発現するには、得られた上流因子のセットだけでは不十分である可能性を示唆している。Nodalの発現調節については、(1)新たな上流因子が必要である、(2)定量的な調節やエピジェネティックな発現調節が関わっている、という２つの可能性が考えられた。私は(1)の可能性について検証し、その結果、ZF143 (FOG＝Friend Of Gata)遺伝子を追加したセットがNodalの発現を引き起こすのに十分である可能性が高いというデータが得られた。このデータの再現性が確認できれば、32細胞期で発現を開始する13個の下流遺伝子全てについての発現調節の全体像が明らかになる。
本研究の申請時において、Nodalのような結果が得られる可能性は十分に想定しており、その場合行うべき解析について既に計画していたため、順調に解析を進めることができた。以上の進展状況から、本研究課題はおおむね順調に進展しているといえる。

Strategy for Future Research Activity

64細胞期に発現を始める調節遺伝子30個（23の異なる発現パターンを示す）を対象にそれぞれの発現調節機構を解明する。32細胞期の場合と同様にそれぞれの下流遺伝子ごとに発現を説明できる上流因子の組合せを明らかにする。上流因子と下流の調節遺伝子の数は限られており、また32細胞期の研究において確立した方法論が適用できることから、本研究計画は十分に実現可能であると考えている。実際には、30個全ての調節遺伝子についての解析を同時に進めることは時間的に困難だと考えられる。まずは、組織の特殊化に関わるキー遺伝子（T, Mrf, Twist-r.aなど）を含む12遺伝子についてそれぞれの発現を説明できる上流因子の組合せを明らかにしていく予定である。
上流因子の候補として、母性因子、16細胞期から発現を始める調節因子、32細胞期から発現を始める調節因子が挙げられる。これまでに調節因子の機能阻害にはMOを用いてきた。しかし、32細胞期に発現を始める調節因子13個に対しては、有効なMOがないものがある。そこで、それらの調節因子に対してはゲノム編集技術（TALEN,CRISPR/Cas9）を用いた機能阻害を考えている。受入研究室において、これらのゲノム編集技術はすでに確立されている。