2020 Fiscal Year Research-status Report
NASH憎悪因子である悪玉ミュータンス菌の検出キットの開発
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20K02352
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| Research Institution | Hiroshima International University |
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Principal Investigator |
長嶺 憲太郎 広島国際大学, 健康科学部, 教授 (80412352)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北川 雅恵 広島大学, 病院(歯), 助教 (10403627)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | LAMP法 / NASH / ミュータンス菌 / ストロンチウムアパタイト / 口腔内細菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、唾液中に含まれているミュータンス菌の中でもcnm+/pa+ S.mutansを短時間に且つ簡便に検出する方法を確立し、cnm+/pa+ S.mutansの保有頻度と対象者背景との関連性を明らかにすることを目的としている。今回、等温で遺伝子を増幅できるLAMP法を用いた検出法の確立に関する研究を行った。
現在までに、cnm遺伝子を検出するLAMP用プライマーの設計を終了しており、精製したDNAレベルで特異的に検出できることを確認している。今回、更に詳細な検討を行った結果、本技術がcnm遺伝子を十分検出できるレベルであることを確認し、その結果を報告した（Kitagawa et.al. Analytical Biochemistry Volume 605, 113812, 2020）。すなわち、口腔内細菌のうちジンジバリス菌、ソブリヌス菌、カンジダ菌のDNAを鋳型としてLAMP反応を行っても、これらの細菌は検出できなかった。これは、他の細菌と区別して特異的に検出できていることをあらわしている。また、従来であれば細菌からDNAを抽出して遺伝子増幅法の鋳型として用いていたが、本技術を用いれば、細菌からDNAの抽出をしなくても検出できることを見出し、より簡便に検出操作が行える事を示した。
更に、唾液からのDNAの抽出方法についても検討した。この結果、ストロンチウムアパタイトを用いることによって簡便にDNAを抽出できることを見出し、その成果を特許出願した（特願2020-033984）。すなわち、加熱処理した唾液中に粉末状のストロンチウムアパタイトを少量入れ5分間転倒混和した後、遠心分離して得られたストロンチウムアパタイトをLAMP反応液に入れるだけで検出できた。これは、使用するチューブが1本で済み、抽出操作の時間短縮にもつながるため、汎用的に利用されることが期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の目標は、cnm遺伝子およびpa遺伝子に対する特異的なプライマーの作製であった。これらのうち、cnm遺伝子に対するプライマーは当初計画した1,000個以下のcnm+ S.mutansを検出できるものが作製できた。pa遺伝子に対する特異的なプライマーは、特異的とみられる塩基配列をピックアップし、プライマー合成まで完了している。
これまでに収集した20代の健常人ボランティアの唾液102サンプルに関して、cnm遺伝子の有無を検討した。この結果、102サンプル中27サンプルにおいてcnm遺伝子を持つミュータンス菌であることが判明した（保有率26.4%）。
当初の計画にはなかったが、ミュータンス菌からDNAを短時間に且つ簡便に抽出する方法を確立することが出来た。今後、多くのサンプルを処理しなければならないが、本技術により時間の短縮になることが期待できる。
一方で、今年度はコロナの影響もあり、新たな唾液を用いた検討に関して実験が停止している状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
pa遺伝子に対する高感度な特異的プライマーの作製を目指す。Pa遺伝子の塩基配列から5種類のプライマーを選定した。今後、これらのプライマーを用いてLAMP反応の条件検討を進めていくつもりである。
また、コロナの影響で唾液のサンプリングができない状況であったが、感染者集が減少してきたタイミングでサンプリングを行い、検討していく予定である。これまでに収集した健常者の唾液102サンプルを用いてpa遺伝子の保有状況について検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
コロナの影響で唾液の収集が思い通りに進まなかったため。使用計画については、翌年度分と合わせて遺伝子増幅に関する試薬類を購入する計画である。
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