2020 Fiscal Year Research-status Report
表面プラズモン共鳴を利用したライブセルイメージング装置の開発と可視光毒性の解明
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20K04521
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
松山 哲也 大阪府立大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (70347508)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ライブセルイメージング / プラズモン共鳴 / 光毒性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，表面プラズモン共鳴による蛍光増強効果を利用した高感度ライブセルイメージング装置を開発し，光制御技術と組み合わせ，レーザー光を生細胞に照射し，照射後の生細胞の動態を詳細に観察することにより，光毒性の発生機構を解明することを目指している．令和2年度は，表面プラズモン共鳴を用いたライブセルイメージングを行うために必要な金属微粒子構造を持つ生細胞培養基板の作成と波長375nm，405nmのレーザー光の光毒性の定量的な比較を行った．
細胞培養基板の作成においては，基板上に金属半球を配置した構造に対しFDTD計算を行い，プラズモン共鳴波長をシミュレートするとともに，薄膜成膜後に電気炉で加熱処理するという簡易な手法により金，銀，アルミニウムの金属微粒子構造を作成し，消光スペクトルを測定することにより，細胞内の蛍光タンパク質からの蛍光増強について検討した．成膜する金属種，初期膜厚，加熱温度，加熱時間をパラメータとして，微粒子構造を作成し，AFM，SEMを用いた微粒子構造の評価，分光光度計を用いた消光スペクトル評価を行い，生細胞培養基板としての構造最適化を行った．
光毒性の定量評価においては，生細胞の細胞核中心に波長375nm，405nmのレーザー光を照射し，その後の細胞増殖核抗原（PCNA）の集積を評価し，光毒性の波長依存性について調べた．PCNA集積によりDNAへのダメージ（光毒性）を評価する手法は本研究独自の手法である．照射レーザー光強度が低い場合，波長405nmに比べ，波長375nmのレーザー光の照射部でPCNAの集積度がより高くなるが，照射強度が高くなるにつれ，波長375nmのレーザー光照射部の集積度がより低くなることが確認された．今後，レーザー光照射後の細胞の24時間観察を行い，細胞生存率について調べ，PCNAの集積と細胞生存率の相関について調べる予定である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和2年度においては当初の計画通り，生細胞培養基板の開発を行うとともに，表面プラズモン共鳴を用いたライブセルイメージング装置の開発を行った．生細胞観察に適した細胞培養基板の研究を進め，細胞内の蛍光タンパク質観察に適した基板構造最適化を行い，微粒子構造の形成についての知見を得た．新型コロナウイルス感染症の影響により高感度sCMOSカメラの選定に時間がかかったが，短波長レーザー光照射による光毒性の波長依存性の評価を行いながら，sCMOSカメラの選定を進め，年度末までに購入済みであり，既存の蛍光顕微鏡と組み合わせ，開発した細胞培養基板上に生細胞を培養し，観察可能な実験系が完成しており，概ね順調に進展している．
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度においては，作成した細胞培養基板を用いて，基板上，基板の初期膜厚と同じ膜厚の金属薄膜上，ガラス基板上などで実際に細胞培養を行い，ライブセルイメージングにより得られる蛍光強度の比較を行い，表面プラズモン共鳴を用いたライブセルイメージング装置の評価を行うとともに，光毒性の定量評価についての研究を進める．また，金薄膜を加熱処理することにより形成されるランダム微粒子構造を用いた細胞培養基板では，プラズモン共鳴波長以外の光の透過率も低下することが確認されたため，電子ビームリソグラフィなどの微細加工技術を用いた細胞培養基板についても研究を行う予定である．
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症の影響により購入物品の選定が進まなかったこと，参加した全ての学会がオンライン開催となり旅費が不要になったこと，年度末までに論文の投稿準備が完了しなかったため校閲費が不必要になったことなどにより支出が減ったため，次年度使用額が生じた．令和3年度において顕微鏡の選定などを行い支出する予定である．
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