2020 Fiscal Year Research-status Report
Effects of environmental factors on specific growth rates of individual microorganisms in bioprocess using microbial consortia
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20K05225
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| Research Institution | Yokohama National University |
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Principal Investigator |
鈴木 市郎 横浜国立大学, 大学院工学研究院, 特別研究教員 (90303081)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | マイクロバイオーム / 時系列データ解析 / 比増殖速度 / 硝化細菌 / 16Sアンプリコン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は申請者らが独自に開発したマイクロバイオーム動態解析法をもとに、様々な微生物を含む「微生物叢」を用いたバイオプロセスにおいて、培養温度などの環境因子の違いが個々の細菌の増殖に与える影響を簡便かつ詳細に解析し、微生物叢を用いたバイオプロセスの高機能化・高度化に活用する新しい手法を確立することを目的としている。従来のマイクロバイオーム解析法が疫学的・統計学的であるのに対し、本研究で確立を目指す解析法は生物化学工学的・速度論的な手法であることを特徴とする。
本研究では使用する微生物叢として硝化細菌を含む細菌叢を用い、アンモニアを含む培地において、培養温度や初発アンモニア濃度など環境因子の異なる培養での個々の細菌の比増殖速度への影響を解析する。この培養の特徴は、アンモニアとその酸化で生じる亜硝酸がアンモニア酸化細菌、亜硝酸酸化細菌のエネルギー源となり、消費された基質が次の基質へと連鎖する複雑な過程を辿ることであり、各細菌の比増殖速度や基質消費速度などを精査することにより、細菌叢内の各細菌の相互作用も考察することができる。研究初年度では、複数の硝化細菌を含む細菌叢を用い、培養液に含まれるアンモニアが25℃、1週間の培養で亜硝酸を経て硝酸に酸化されることを確認した。また、培養中に経時的に採取した培養液より細菌DNAを抽出し、全細菌16S rRNA遺伝子濃度やアンモニア酸化細菌のamoA遺伝子濃度の増減を調べた。
一方、COVID-19による緊急事態宣言発令に伴う研究室への入室制限などの制約により、培養実験から選抜した試料からのPCRで増幅した細菌16S rRNA遺伝子断片(16S rRNA遺伝子アンプリコン)塩基配列の次世代シーケンス(NGS)による解読は実施できなかった。研究実施者が在宅でも細菌叢のNGSデータを解析可能な環境を整備し、次年度からのNGSデータ解析に備えた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究の進捗状況を、A)異なる環境因子の条件下での細菌叢を用いた培養実験、B)その時の各細菌の増殖についてのマイクロバイオーム動態解析法を用いた速度論的解析、の2点に分けて評価する。
A)の培養は、硝化細菌群集を用いたアンモニア除去プロセスを対象とした。使用する硝化細菌群集には複数種類のアンモニア酸化細菌、亜硝酸酸化細菌が含まれることを、細菌16S rRNA遺伝子アンプリコンのNGSデータ解析で確認した。次に、硝化細菌を含む細菌叢の培養方法などを検討した。25℃での1週間の培養で20 ppmのアンモニアからの亜硝酸を経て硝酸への酸化を観察した。また、経時的に採取した培養液から細菌DNAを抽出して細菌濃度の変遷を細菌の16S rRNA遺伝子やアンモニア酸化細菌のamoA遺伝子を対象とした定量PCRによって解析した。なお他の温度での培養は、COVID-19による緊急事態宣言発令に伴う研究室への入室制限に起因する時間的制約により実行できなかった。
B)のデータ解析は、上述の理由により培養サンプル取得が遅れたことから、初年度の培養実験から選抜した試料からの細菌叢動態のNGSデータ解析は実施できなかった。一方、NGSデータ解析用のワークステーションとして使用可能な性能を有するノート型PCを購入した。このノートPCを用いて、既に所持していた硝化細菌培養実験の16S rRNA遺伝子アンプリコンデータをもとに各硝化細菌の増殖の時系列データ解析を行い、在宅環境でもNGSデータ解析が可能であることを確認した。なお、実施しなかったNGS解析や発表予定の学会の中止で使用しなかった旅費等の経費は、次年度に繰り越した。
以上から、A)、B)ともに当初予定より遅れはあるものの研究自体は確実に進捗しており、遅れの生じた項目については次年度内に実施する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では様々な細菌からなる細菌叢を用いたバイオプロセスにおいて、申請者らが独自に開発したマイクロバイオーム動態解析法をもとに、個々の細菌の比増殖速度を求め、温度や初発基質濃度などの環境因子の違いが各細菌の比増殖速度に与える影響を詳細に調査することにより、細菌叢を用いたバイオプロセスの機構をより深く考察しその効率化・高機能化に寄与する、新しい解析手法を確立することを目的としている。
初年度に引き続き次年度以降では、A)異なる温度または初発アンモニア濃度での硝化細菌を含む細菌叢の培養、B)その培養での細菌叢の動態の時系列データ解析と、温度や初発アンモニア濃度の変化に対応する細菌群の選抜、その比増殖速度への温度や初発アンモニア濃度の影響の解析、を順次行い、最終的に本研究の成果を新しいマイクロバイオーム時系列データ解析法としてまとめる。
具体的には、異なる培養温度5条件、異なる初発アンモニア濃度5条件での培養を次年度で実施し、経時的に採取した培養液からアンモニア、亜硝酸、硝酸の各濃度を測定、細菌叢のDNAを抽出して定量PCRを用いた全細菌16S rRNA遺伝子濃度の測定と16S rRNA遺伝子アンプリコン塩基配列のNGSを用いた解読を順次行う。得られたNGSデータから、マイクロバイオーム動態解析法を用いて温度など環境因子の違いに応答する細菌群を選択し、それら各細菌の比増殖速度を算出する。そして、培養中の環境因子の違いが各細菌の増殖に与える影響を評価する。研究成果は、学会発表や論文等によって順次公表する。
なお、初年度の進捗の遅れの要因となったCOVID-19による緊急事態宣言発令に伴う研究室への入室制限は充分な感染症対策を行うことで緩和されたため、次年度以降の研究への影響は最小限となる予定である。
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| Causes of Carryover |
COVID-19による緊急事態宣言発令に伴う大学への入構制限、研究室への入室制限による制約により、当初予定していた初年度の培養実験の一部とそれら培養実験で採取した試料からの細菌叢組成の次世代シーケンス(NGS)解析の外注が全く実施できなかった。従って、当初予定していたNGS解析外注費用558千円（186千円×3回、費目名「その他」に該当）を初年度には使用せず、次年度に使用することとした）。また成果を発表する予定の学会大会が中止されたため、発表の旅費・宿泊費として計上していた159千円（費目名「旅費」）が使用できなかった。それ以外の差額19,392円は、培養実験が当初予定通りに実施できなかったことにより、そのまま未使用とした。
次年度では遅れていた培養実験を実施して、未使用分のNGS解析外注費用を消化する。学会の出張旅費については、次年度もオンラインでの学会大会となる可能性が高いため、旅費として使用できない場合は最終年度に繰り越すか、実験の試薬消耗品として消化する。
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