2020 Fiscal Year Research-status Report

Fabrication of DDS carriers having Targeting and Environmental Recognition Abilities

Research Project

Project/Area Number	20K05264
Research Institution	Nagoya Institute of Technology
Principal Investigator	樋口真弘名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (50357836)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	ドラックデリバリーシステム / ターゲット認識能 / 環境認識能 / ペプチド脂質 / ベシクル / 炭酸カルシウム / 自己供給型ミネラリゼーション
Outline of Annual Research Achievements	癌の化学療法のための薬物送達システムとして、ターゲット認識能及び環境認識能を併せ持つナノカプセルの構築を目的とする。同ナノカプセルの条件として、環境認識能では脂質ベシクル表面が酸性条件下で溶解する炭酸カルシウムで被覆されること、また、その表面にターゲット認識能として種々の受容器を簡便に導入可能であることとした。本年度は、薬物送達システムとしてのナノカプセルに、ターゲット認識能を付与することを目的に、ターゲット物質との相補的相互作用により自己組織化的に、そのターゲット物質を特異的に認識する結合サイトをベシクル表面に構築することを試みた。また、ナノカプセルに環境認識能を付与することを目的に、ベシクルの外水相表面のみを弱酸性条件下で溶解する炭酸カルシウムで被覆することを試みた。これは、癌組織近傍が弱酸性であることから、正常細胞組織近傍での薬物放出が抑制され、副作用が有効に阻害できると考えたからである。これらの目標のため、ポリエチレングリコール／ペプチドブロック共重合体を親水部に、二本鎖のアルキル鎖を疎水部に有するペプチド脂質を合成した。このペプチド脂質を脂質二分子膜ベシクルに埋め込み、ベシクル外水相表面での炭酸カルシウムの自己供給型ミネラリゼーションを行った。ペプチド脂質の親水部であるポリエチレングリコール／ペプチドブロック共重合体末端には、種々の官能基を簡便に導入可能なチオール基を導入した。同ペプチド脂質含有ベシクル表面でのミネラリゼーションを行い、ベシクル外水相表面に形成される炭酸カルシウム殻の膜厚及びその結晶構造に関し詳細に検討した。また、酸性条件での炭酸カルシウム殻の溶解に関し、初歩的な検討を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 炭酸カルシウム自己供給型ミネラリゼーション能を有し、末端に標的癌細胞に特異的に結合する断片を簡便に導入可能な官能基を有するペプチド脂質の合成を行った。ペプチド脂質の親水性部位は、炭酸カルシウムミネラリゼーションのミネラル源である炭酸イオンを、尿素の加水分解により供給可能な,Val-His-Val-Glu-Val-Ser,のアミノ酸シーケンスより成るペプチドを用いた。同ペプチドのC末端にはポリエチレングリコールを介して、各種官能基を容易に導入できるチオール基を有するシステインを導入した。加えて、N末端にはリジンを介して、脂質膜へのアンカー部位としてのステアリン酸を2分子導入した。得られたペプチド脂質を種々の相転移温度を有する脂質二分子膜ベシクルに埋め込み、炭酸カルシウムミネラリゼーションを行ったところ、液晶状態を取るベシクル表面上でのミネラリゼーションが優位に進行した。これは膜中でのペプチド脂質の側方拡散によりペプチド同士の衝突が生じることで、尿素の加水分解、即ち、ミネラル源の炭酸イオンの発生が促進されたためと考えられる。得られた炭酸カルシウム被覆ベシクルは、TEM観察の際の高真空条件下でも、中空球状の形状を保持したが、pH 6の条件下では、炭酸カルシウム殻が溶解し、中空構造が崩壊した。この特徴は、癌組織近傍のpH環境を認識し、薬物を放出可能なDDS担体として有望であると考えられる。また、予備的検討としてターゲット認識能の付与を検討した。末端に種々の糖鎖を導入したペプチドを脂質二分子膜に埋め込み、種々のレクチンとの相補的相互作用によりベシクル表面にペプチドの再配列による、対象レクチンの結合サイト形成を行った。同手法では、対象としたレクチンに対する特異的な結合サイトが形成されることが分かり、ターゲット認識能を付与する手法として有効であることが示された。
Strategy for Future Research Activity	令和3年度は、炭酸カルシウム被覆ベシクルに実際の抗癌剤を内包させて、種々のpH条件下での薬物放出試験を行う。具体的には、ベシクル調製時に抗癌剤であるフルオロウラシルを内包し、令和2年度に得られた知見を基に、そのベシクルの外水相表面のみを自己供給型ミネラリゼーションにより炭酸カルシウム殻で被覆する。初めに薬物担持炭酸カルシウム被覆ベシクルの粒径測定を行い、EPR効果が発現可能な粒径200 nm以下の粒子が得られる条件検討を行う。次に、得られるベシクルからのフルオロウラシルの放出挙動について、癌組織近傍のpH 6.5、正常組織近傍のpH 7.5を初め、種々のpH条件下で検討する。これと同時に、それぞれのpH条件下での炭酸カルシウム殻の崩壊を、溶解した炭酸カルシウム量、即ちカルシウムイオン生成量より評価し、薬物放出と炭酸カルシウム殻崩壊との相関を検討する。薬物担持炭酸カルシウム被覆ベシクルのターゲット認識能評価に関してのモデル系の構築に関し検討を行う。最終的には令和2年度報告のターゲットとの相補的相互作用により構築される受容体をベシクル表面に誘起することを目的とするが、その前段階として、ベシクル表面にターゲット物質に対する特異的結合能を付与することを行う。具体的には、2官能性試薬を用いてペプチド脂質末端のチオール基にビオチンを導入する。この系にアビジンを添加することで、アビジン－ビオチン間の結合による、炭酸カルシウム被覆ベシクルの凝集から、認識能を評価する。