2020 Fiscal Year Research-status Report
高い構造異方性を持つ細胞透過性人工タンパク質の細胞透過機構の解明
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20K05285
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| Research Institution | Nippon Institute of Technology |
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Principal Investigator |
佐野 健一 日本工業大学, 基幹工学部, 教授 (80321769)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池添 泰弘 日本工業大学, 基幹工学部, 教授 (70334315)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞内デリバリー / コイルドコイル構造 / ナノ構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者らが創製したCCPC 140と名付けた細胞内DDS担体は、剛直で高い構造異方性を有するカチオン性人工タンパク質であり、既知の細胞透過性ペプチドと比べ、極めて高い細胞透過活性を示す。このCCPC 140が細胞膜を透過する機構は、主に広義のエンドサイトーシスによるが、その詳細に未だ明らかになっていない。本研究では、特にグリコサミノグリカンとCCPC 140との相互作用に焦点を当てた研究を進めている。R2年度は、グリコサミノグリカン依存的な能動輸送経路におけるCCPC 140の物理化学的性質によって活性化されるパスウェイ解析に向けた研究を主に進めた。
CCPC 140と同じく剛直で高い構造異方性を持つが分子表面がほぼ中性の電荷を持つ変異体、CCPC 140と同じく分子表面がカチオン性であるが、構造を取らない変異体について、細胞表面のグリコサミノグリカンを欠損する変異株に対する細胞透過活性を評価した。その結果、CCPC 140は、グリコサミノグリカン非依存経路においても細胞自身が持つ、エンドサイトーシス能を最大限まで活性化することができること、グリコサミノグリカン依存経路において、剛直で高い構造異方性は分子表面電荷ほど大きな効果を示さないことを明らかにした。次に、各エンドサイトーシス阻害剤の影響についても調べた。その結果、構造を取らないカチオン性分子とは異なり、CCPC 140のエンドサイトーシスの活性化には、Rhoの活性化を必要としないことが明らかになった。
また、TurboID法による網羅的なCCPC 140相互作用タンパク質およびシグナル伝達経路の同定に向け、TurboIDを融合したCCPC 140のキメラタンパク質の発現系の作製に成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本申請研究は、グリコサミノグリカン依存的な能動輸送経路におけるCCPC 140の物理化学的性質によって活性化されるパスウェイの解析と高い構造異方性を持つカチオン分子が細胞膜に与える物理刺激を膜張力、膜粘度変化として定量的に評価するものである。前者については、順調なデータ取得が進んでおり、現在、査読誌への投稿論文を執筆中であることからも、概ね計画通りに進んでいる。またTurboID法による網羅的なCCPC 140と相互作用する膜タンパク質、エンドサイトーシスを誘起するシグナル伝達経路の同定に向けたキメラタンパク質の作製も順調に進んでいる。後者の物理刺激の定量評価について、研究分担者による装置の改良およびモデル細胞膜を用いた基礎データの取得も進んでおり、受動輸送経路の解明に向けた研究の進展も順調である。これらの結果を鑑みて「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
R3年度は、引き続き阻害剤を用いたCCPC 140の物理化学的性質によって活性化されるパスウェイの解析を進めることと並行して、TurboID-CCPC 140キメラタンパク質を用いた、TurboID法の条件検討を進め、網羅的なCCPC 140相互作用タンパク質およびシグナル伝達経路の同定をおこなう。
また、R2年度の成果を元にCCPC 140のモデル脂質膜表面への吸着とそれに伴う膜張力・粘度の変化のリアルタイム計測により、細胞膜に誘起される直接的な物理ストレスを定量する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症の影響で外国旅費に計上していた環太平洋化学会における研究発表については、学会の2021年への延期に伴い次年度に繰り延べた。
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