2020 Fiscal Year Research-status Report
グラフェン支持膜を用いた真空下での電子顕微鏡試料作製法に関する基盤技術の開発
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20K05286
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| Research Institution | Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University |
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Principal Investigator |
山下 真生 沖縄科学技術大学院大学, 量子波光学顕微鏡ユニット, 研究員 (10727639)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安谷屋 秀仁 沖縄科学技術大学院大学, 量子波光学顕微鏡ユニット, 技術員 (00868721)
CHEUNG Martin 沖縄科学技術大学院大学, 量子波光学顕微鏡ユニット, 技術員 (90832163)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | エレクトロスプレー / 電子顕微鏡試料作製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究計画調書の研究実施計画(図4)に基づき、2020年度はESI法の最適化と電子顕微鏡用試料ホルダーの開発に取り組んだ。前者については、神経科学などの分野で利用されるマイクロインジェクションニードルの作製技術を応用して先端径2から20マイクロメートルのガラス製ESIキャピラリーを作製し、生体高分子水溶液を用いてそれらの性能試験を行った。粘性、溶媒の表面張力が共に高い生体高分子水溶液からの良好な微細液滴の生成は、先端径5マイクロメートル以下の極細径キャピラリーを使用することによってのみ可能であったが、これらのキャピラリーは目詰まりを起こし易く、またキャピラリーに試料溶液を通す際に非常に高い送液圧力が必要となるため、安定したESIのオペレーションが困難であった。そこで我々はキャピラリーの先端をベベル型に成形し、且つベベル先端部に微細なスパイクを追加することで、10から20マイクロメートル程度の先端径が大きなキャピラリーで極細径キャピラリーと同等の結果を得ることに成功した。これにより正負両イオンモードにおいて幅広い生体高分子試料へのESI法の適用が可能となり、ESI法の電子顕微鏡試料作製への応用における重要な技術目標の一つを達成することができた。2021年度はこの改良型ESIキャピラリーを用いて真空分子蒸着装置による蒸着条件の最適化を実施する予定である。もう一つの課題である電子顕微鏡試料ホルダー開発については、当初市販の真空封止搬送機構を備えたTEMホルダーに試料加熱機構を組み込む形での開発を検討していたが、検討の結果開発費が当初の見込みを大幅に超過することが判明したため、最終的に真空封止ではなく不活性ガス雰囲気下で試料を搬送する方式を採用することとした。このホルダーの作製は2021年3月に完了し現在真空分子蒸着装置に搭載した状態での性能試験を実施している段階である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年度は概ね研究計画調書の研究実施計画通りに研究を進めることができたと考えている。本研究では2021年度末までに生物試料を中心とする5種類程度の試料についてESI条件を最適化することを目標としているが、概要の欄で述べた新型のESIキャピラリーを用いることでこの最適化作業が大きく前進した。これは新型ESIキャピラリーでは酢酸アンモニウムのような揮発性緩衝液中で調製した生物試料を従来型のキャピラリーと比べより容易にスプレーできるようになったことが大きく、その結果様々な生物試料について試料側の高度な最適化を経ずとも良好なスプレー条件を確立することが可能となった。これまでに最適化が完了した試料はエリスロクルオリン複合体、プラスミドDNA、細菌細胞膜断片の3種類である。これらの分子は分子サイズが20から200ナノメートルと走査型電子顕微鏡での観察に適したサイズであることから、ESI法で生成した分子イオンを大気中で電子顕微鏡試料グリッドに直接蒸着した試料を作製し、それらを走査型電子顕微鏡で観察することで分子イオンの構造と試料の脱溶媒効率の評価を行った。その結果、いずれの試料についてもESI法の適用後に分子形状(四次構造)に大きな変化は見られず、また試料から溶媒の気化除去はESI法により生成した微細液滴が約2ミリメートル離れた試料グリッド(コレクター電極)に飛来するまでの間にほぼ完了していることが確認できた。ESI法を用いて作製した細胞膜断片イオンはそのままの状態で走査型電子顕微鏡の高分解能イメージングに供することが可能で、その結果得られた生体膜の表面構造は原子間力顕微鏡により得られたものに非常に近いものであった。このようなイメージングは前例がないことから、これまでに得られた結果を学術論文として公表するため現在投稿準備を進めているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度は上述した改良型ESIキャピラリーを真空分子蒸着装置に搭載し、真空下でのグラフェン支持膜試料グリッドへのデポジション条件の確立に取り組む。真空下での実験を進めていく上で大きな問題となるのは大気中で生成した試料分子の分子イオンを効率的に真空チャンバーに導入する装置条件を確立することである。現在の真空分子蒸着装置のイオン導入部には質量分析計に見られる静電レンズのようなイオン収束機構がなく、予備実験の結果からは大気中で生成したイオンのわずか1/10000程度の分子しか真空中に導入できていないことが判明した。加えて、巨大生体高分子試料の場合、水溶液中での凝集や溶液の粘性の増加を抑えるため溶液中の分子密度を高く設定することが難しく、真空中に導入されるイオン量は更に1/1000程度に減衰する。この問題点を解決し実用的な真空中での試料作製ルーチンを確立するために2021年度中にイオン導入部の改良に取り組むことを計画している。具体的には現在の装置のイオン導入部にイオン収束機構を追加し、テストを行う予定である。これと並行して更に3種類の生体高分子試料(リポソーム、赤痢菌のⅢ型分泌装置複合体、バクテリオファージ)についてもESI条件の最適化を実施する予定である。一方、最適化の実験で用いた大気中でのESI分子蒸着法はグラフェン以外の試料支持膜を用いる場合、非常に有効な試料作製法になり得る可能性がこれまでの実験結果から示唆された。従って、真空分子蒸着法と共にこちらについても(特に走査型電子顕微鏡観察と組み合させた新規イメージング手法の確立を目指して)検討を進めていく計画である。
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| Causes of Carryover |
生じた次年度使用額は、研究の遂行に必要な消耗品を購入した後に残った金額になります。額が比較的少額で真に必要な物品を購入するには額が十分でないため、次年度の消耗品の購入費として使用させていただくことと致しました。
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Research Products
(1 results)
