2020 Fiscal Year Research-status Report
分子間架橋酵素電極による生体内微量D-アミノ酸の高感度・高選択的定量技術
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20K05292
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
山口 浩 東海大学, 九州教養教育センター, 教授 (00466236)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | D-アミノ酸 / 固定化酵素 / D-アミノ酸酸化酵素 / ヘモグロビン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、様々な遊離D-アミノ酸が生体内に存在し、L-アミノ酸とは異なる生理機能が見出されている。しかし定量分析に課題があり、生理的役割はいまだ明らかになっていない。本研究は分子間架橋技術を用い、2種の酵素を金電極表面に触媒活性を保持したまま高濃度に固定化した酵素電極を開発する。この酵素電極を用いたバイオセンサーを作製し、生体内微量遊離D-アミノ酸の高感度・高選択的で安価な定量分析技術の確立を目指す。
初年度は研究計画に基づき、酸化酵素の固相表面への共固定化条件の確立を行った。酵素にはD-アミノ酸酸化酵素とヘモグロビンを利用した。2種の酵素の等電点は酸性であり、以前の研究から酵素の固定化にはポリリジンが必要である。高い酵素重合率と触媒活性を両立する為、酵素濃度、ポリリジンの濃度および架橋剤であるアルデヒド濃度を検討した。マイクロビーズには、アミノ基修飾PEGAビーズを利用した。酵素はポリリジンが形成する重合体へ取り込まれることでビーズ表面へ積層され、高濃度の酵素を固定化できる。このPEGAビーズへの酵素の固定化とその有効性は論文として発表した。
酵素反応は、少量のビーズを用いてサンプルチューブ内で簡便かつ迅速に行った。その結果、酵素は期待通りに高濃度でPEGAビーズへ固定化できた。反応温度30度において、40回以上の繰り返し利用が可能であった。この事は酵素分子の立体構造は損なわれずに、高濃度でかつ自由度が低い酵素重合体が形成されることで、長時間その触媒活性が持続し安定性が増加したと考えられた。しかしながら反応温度を上昇するとその安定性の低下が観測された。現在、架橋反応条件（架橋剤、各試薬濃度など）を再検討し、最適化を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の研究計画は、2種の酵素の固相表面への共固定化条件の確立であった。固定化条件の最適化は引き続き行っているが検討中ではあるが、一般的な分析温度の30度で、活性を保持したままで40回以上の繰り返し利用が可能な固定化条件を確認できた。その為、研究はおおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
得られた固定化条件を金電極表面へ応用して、酵素電極を作製し、電気化学的手法でD-アミノ酸の定量分析法を確立する。加えて、初年度で得られたPEGAビーズに共固定化した酵素を用いて、分光学的（基質もしくは補酵素に由来）にD-アミノ酸の定量分析法も併せて開発し、生体内微量遊離D-アミノ酸の高感度・高選択的で安価な定量分析技術の確立を目指す。
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| Causes of Carryover |
消耗品購入において、購入金額は予定よりも安価であったため差額が生じた。次年度使用額分は今年度の試薬等の消耗品購入に使用する。
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