2021 Fiscal Year Research-status Report
平行平板電極による高安定な電気化学インピーダンスバイオセンサの作製と応用
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20K05300
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| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
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Principal Investigator |
大貫 等 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (60223898)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 電気化学インピーダンス法 / バイオセンサ / コルチゾール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度，Covid-19の蔓延のため当初想定していたスケジュールで研究を進めることが困難であった．そこで本年度は新たに測定システム（ポテンショスタット）を追加して研究の全体的なスピードアップを図ったことで，これまでの遅れを取り戻すことができた．具体的な研究項目としては次の3点である：1) 2電極基板用試料ホルダの開発，2) 2電極基板による非特異吸着成分の除去，3) 唾液中コルチゾール測定．それぞれの進捗状況については次項に述べる．
本年度新たに判明した知見は次の2点である．1)非特異吸着現象において，ブロッキング分子と抗体分子では非特異吸着現象そのものがかなり異なるため，単純な差分による非特異吸着成分の除去は困難である可能性がある．具体的には，ブロッキング修飾表面から推定される非特異吸着量の信号成分を，抗体分子+ブロッキング分子で構成されるセンサ表面からの信号成分から差し引くと，引きすぎてしまい逆に真の値から外れていくことが判明した．この結果が示唆するのは，ブロッキング表面と抗体+ブロッキング表面（センサ表面）では吸着メカニズムが大きく異なっており（例えば後者では平滑なブロッキング表面となっているためクラスター化したコルチゾールが吸着する等），これをセンサ表面での非特異吸着モデルとして使用するのは不適当かもしれない，という点である．2)平行平板電極は非常に再現性が高く，不純物を含む唾液試料であってもELISAと同程度の精度が得られることが分かった．ただし，電荷移動抵抗値の変化ではなく，その逆数を指標として使用するほうが良い一致が得られることが判明した．逆数は表面における電気伝導度に相当し，表面被覆率に比例する量となる．唾液中のコルチゾール濃度の変化幅は比較的狭い範囲であるので，この狭い範囲を精度よく測定するためには，逆数での評価方法が非常に有効になると考える．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記した3つの研究項目における概要をそれぞれ以下に示す．
1) 2電極基板用試料ホルダの開発:前年度開発した2電極タイプの電極を2枚向かい合わせに重ね，平行平板構造の電極として確実に保持するとともに，上下各2つ計4つの電極へコンタクトを行う専用ホルダを設計・作製した．これを用いることで2電極基板の測定を安定に行えるようになった．
2) 2電極基板による非特異吸着成分の除去:2電極基板では同一の表面修飾を行った場合，表面修飾が同一条件下で行われるため2電極は同じ信号強度を与えるセンサとなるはずである．まずこの点を実験的に確認したところ，広い濃度範囲でほぼ同一の信号強度を示すことが分かった．さらに，2電極基板の1つをコルチゾール抗体修飾したコルチゾールセンサ表面，他方を不活性 Amino-PEG で修飾したブランク電極，とした異なる表面修飾の試料基板を作製した．この場合，後者ではコルチゾールが非特異吸着のみで吸着する．コルチゾール濃度に対する反応は，前者で通常の信号強度となる一方，後者はその20%程度であった．従って，非特異吸着の寄与を試料ごとに評価することが可能であることが分かった．しかし，実際に唾液試料を用いて両者の差分を取って信号とすると過少推定となってしまうことが判明した．原因として，前者と後者の表面での非特異吸着メカニズムが異なるのではないかと推察している．
3) 唾液中コルチゾール測定：生体試料である唾液に含まれるコルチゾール濃度を標準法であるELISAと開発したインピーダンス法で測定し，結果を比較した．その結果，インピーダンス計測においては，従来法のように電荷移動抵抗値で解析する場合に比べ，その逆数で解析を行う方がELISAの結果とよく一致することが分かった．これは電荷移動抵抗の逆数が表面電導度に相当し，分子の被覆率と直接比例する量となるためであろうと考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の差分による非特異吸着の除去について，ブロッキング分子と抗体分子では非特異吸着現象そのものがかなり異なるため，単純な差分による非特異吸着成分の除去が困難である可能性がある．今後は，これを回避する手法の開発を進めていく．具体的には，1)ブロッキング分子の変更，2)試料洗浄方法の改善を行っていく．
1) について，現在は低分子PEG(ポリエチレングリコール）をブロッキング分子として用いているが，これを他の不活性な分子（牛血清アルブミン，ガゼイン，高分子PEG，エタノールアミン等）に変えることで，この問題を回避できるか試みる．2) については現在，試料洗浄をリン酸バッファ中のリンスで行っている．しかし，より積極的な洗浄方法として界面活性剤などを含む溶液中でのリンスや希薄なエタノール溶液中への浸漬等を検討していく．
一方，コルチゾール濃度推定において電荷移動抵抗の逆数を指標として解析を行うとより精度が向上する点について，これまで以上に測定例を増加させて本手法の検証を行うとともに，このアプローチの理論的な枠組みも構築していく．本研究ように濃度評価の詳細な議論が可能となるのは，ここで用いている平行平板電極構造によるインピーダンス応答プロファイルの高い再現性が基礎となっており，本構造でなければ見出せなかった振舞いであろうと思われる，同様の振舞いはコルチゾールセンサだけでなく他のセンサでも，インピーダンス測定の精度向上に大いに貢献できると考える．
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