2020 Fiscal Year Research-status Report
Method to measure vibrational spectra of proteins in aqueous solution for detection of intermolecular interactions using solid/liquid interface
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20K05415
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
近藤 正人 筑波大学, 数理物質系, 助教 (20611221)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石橋 孝章 筑波大学, 数理物質系, 教授 (70232337)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 振動和周波発生分光 / シリカコート基板 / シランカップリング / 界面 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，固体と液体の界面を利用して，水溶液中のタンパク質の振動スペクトルを水和水のものまで含めて高感度に得る新しい方法論を確立することを目的としている．その基本的なアイデアは，界面敏感な振動分光法である振動和周波発生（VSFG）分光法を，固液界面に向きを制御した上で固定したタンパク質の系に適用することである．この用途に用いるための基板として，シリカ薄膜をコートしたCaF2基板に着目した．この基板では，シリカに試料分子をシランカップリング反応により化学的に固定できる．固液界面のVSFG測定は，水の強い赤外吸収を避けるため，赤外光を基板側から入射する内部反射配置で行う必要がある．シリカは2000 cm-1以下の赤外領域で不透明であるが，薄膜としたうえで赤外領域で透明なCaF2にコートすることで，この配置での測定も可能となる．初年度は，このシリカコートCaF2基板上での有機単分子膜について，内部反射配置でヘテロダイン検出（HD）-VSFG測定を行うための取り組みを行った．
まず，ゾルゲル法によってCaF2（Φ20×t5）上にシリカ薄膜（厚み~100 nm）をコートした．この基板上の有機単分子膜を内部反射配置でHD-VSFG測定するには，試料と同じ面に，参照試料を準備する必要がある．そこでシリカコート面の一部に，スパッタ法で銀薄膜を蒸着した．試料の絶対配向の情報を含んだ量である絶対的な非線形感受率を得るには，その基準となる銀の絶対的な感受率が必要である．そこで，リン脂質DPPCの脂質膜を用いて銀の絶対的な感受率を決定した．DPPCのアルキル鎖が上を向けた脂質膜の絶対的な感受率と，下を向けた膜のものでは，その符号が反転する．このことを利用して，それぞれの膜を，外部および内部反射配置でHD-VSFG測定した結果から，シリカコートCaF2に蒸着した銀薄膜の感受率の値を決定した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究課題の到達目標までの大まかなステップとして，1. シリカコートCaF2基板の簡易な作製方法の確立，2. このシリカコートCaF2基板を利用して内部反射HD-VSFG測定するための手順の確立，3. シリカコートCaF2基板にシランカップリング法でアンカー分子を準備する方法の確立，4. このシランカップリング膜の固気および固液界面での内部反射HD-VSFG測定，そして，5. アンカー分子にタンパク質を固定した系を準備とHD-VSFG測定，以上の段階を計画している．初年度に，このうち二番目の項目，HD-VSFG測定の際の位相基準となる銀の絶対的な感受率の決定まで到達することができた．この点では，当初の計画の通り，おおむね順調に進んでいる．だが，質のいいシリカコートCaF2基板をゾルゲル法で再現性よく準備するにはまだ至っていない．この点を考え，やや遅れているという評価とした．
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度の研究で分かった大事なことの一つは，シリカコートCaF2基板上の銀薄膜（参照試料）のVSFG測定において，信号強度が，コートなしのCaF2基板上のものに比べて，1/10以下となることである．このため，シリカコート基板上の銀薄膜からの信号をガイドに，VSFG装置の光軸調整を行うことができていない．現在は，まずコートなしの基板上の銀薄膜からの信号をガイドに光軸調整を行い，その後に試料をシリカコート基板に交換するという方法で行っている．このため，シリカコート基板上の試料からの信号を得るまでに時間と手間がかかるという問題が生じている．今後，このシリカコート基板に準備した種々の試料について測定を行う必要があることを考えると，現時点でこの問題を解決しておくことが望ましい．そこで，CaF2基板に銀薄膜を蒸着し，その上からシリカコートしたものを参照試料として用いる方法を試すことを計画している．この方法だと，シリカコートの上に準備した試料に対しての参照試料に用いることは厳密にはできない．シリカ層の厚みの分だけ，試料と参照試料の場合でプローブ光の光路に差が生じてしまうからである．だが，この際に生じた光路差に由来するものまでを含める形で銀の感受率を決めておけば，参照試料として用いることができると期待される．感受率の決定方法として，今年度に用いた脂質膜を用いた方法を採用すれば，このような形の実効的な感受率も決定できるはずである．二年目はまずこの方法で信号強度の問題が解決されるのかを試すところから取り組む計画である．
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| Causes of Carryover |
VSFG分光装置の光源であるフェムト秒レーザーシステムの不調を改善するために，本年度使用額の大部分を使用した．残額は，内部反射配置でのVSFG分光測定用の合成石英製プリズム基板の購入に充てることを計画した．まずこの基板を用いた測定がどの程度可能かをテストする用途で，一点だけを購入した．購入後の残額は，テストがうまくいった際にプリズムを別途購入するために残したものである．レーザー不調によりテスト測定を年度末まで行えなかったため，次年度使用額が生じた．年度末に行ったテスト測定で，合成石英製の基板でも測定可能なことが分かったため，この使用額は，合成石英製の基板の購入に充てる計画である．
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