miRNAの生細胞内検出を指向した化学反応プローブの開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K05563
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 柴田 綾 岐阜大学, 工学部, 助教 (50462693)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 遺伝子検出

Outline of Annual Research Achievements

生細胞内の遺伝子検出法として標的核酸を鋳型とした化学反応プローブがある。この遺伝子検出法の利点は標的核酸を鋳型とした反応サイクルを回すことで、シグナルを増幅することができる点にある。しかし、これらのプローブの多くは蛍光基質の構造変化をシグナル発生の鍵としているため、使用できる蛍光波長に制限がある。
本研究では、生細胞内での遺伝子検出が実用可能なプローブの構築を目指し、芳香族求核置換反応を利用した検出プローブの高いシグナル増幅能を維持したまま、クリック反応を利用したポスト修飾により、プローブの簡便な多色化を試みた。本年度は前年度までに合成した分子をDNA鎖に組み込み、標的DNAを鋳型とした反応のサイクルがどの程度回転するかの検討を行った。しかし、0.1等量に標的DNAを減少させた場合、反応の進行がほとんど見られなかった。塩濃度、反応温度などの検討を行ったが改善は見られなかった。
加えて、新たなFRET-Off型遺伝子検出プローブとして自己切断型の遺伝子検出プローブの開発を試みた。こちらは切断の鍵となる分子の設計を行い、合成を進めているところである。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

化学反応プローブの肝であるシグナル増幅が上手くいかないため。

Strategy for Future Research Activity

シグナル増幅能の改善のためDNA鎖長の検討を行う。また、検討に用いる蛍光色素の組み合わせについても検討を行う。自己切断型の遺伝子検出プローブについても切断分子の合成を進め、DNA鎖中に組み込むことにする。

Causes of Carryover

研究の進行に遅れが出ており、細胞を用いた実験を行うことができなかったため。計画に大きな変更はなく、次年度は核酸合成等の消耗品および細胞培養関連能の購入割合が増える予定である。