2020 Fiscal Year Research-status Report
光増感金属錯体を導入した人工蛋白質複合体内チロシンラジカル生成と化学反応系の創製
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20K05567
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| Research Institution | Nara Women's University |
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Principal Investigator |
高島 弘 奈良女子大学, 自然科学系, 准教授 (80335471)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 光電子移動反応 / 酵素 / ルテニウム錯体 / 蛋白質ラジカル / 阻害剤 / 光増感作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、蛋白質・酵素が行う複雑な生体内光電子移動反応を、より単純化したモデルとして人工的に再構築することで、その反応機構の解析や新たな蛋白質の光電子伝達系の創製を目指した基礎的研究を進めてきている。このような光電子伝達系において生成する、生体内の反応活性に大きく影響を与える重要な鍵中間体として蛋白質ラジカルが知られ、例えば、光合成反応中心Photosystem IIにおける水からの酸素発生系(oxygen evolving complex, OEC)に関与するとされるチロシンラジカルが挙げられる。
本研究では、化学的手法により光をエネルギー源とする蛋白質内光誘起電子移動反応系を人工的に構築し、チロシンラジカルのような化学反応中間体を人工蛋白質内に位置選択的かつ安定に生成させる。さらに、その化学反応性を調査するとともに、新規な光触媒反応系への応用を目指す。
蛋白質ラジカル種は一般に単寿命な不安定中間体であり、光合成反応中心で見られるように、なぜどのようにチロシン残基が高い反応活性を保っているかについては、複雑な蛋白質内電子移動反応機構のため明確に結論付けることは未だ容易ではない。そこで本研究では、光増感剤としてトリス（2, 2’-ビピリジン）ルテニウム錯体とその類縁錯体を基体とした新しい酵素-光増感金属錯体複合体の分子設計・構築を行い、その多段階的な光誘起電子移動反応におけるチロシンラジカルの安定な生成を研究当初の目的として試みる。さらに、その化学反応性を系統的に調査するとともに、光触媒系への応用を目指すことを目標としている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究計画の指針においては、（１）構造・機能が良く知られているキモトリプシン（CHT）をまず対象とする酵素として選び、その活性中心への特異的化学修飾に独自の着眼点を置き、酵素複合体を構築する。また、（２）蛋白質内部空間を利用する光電子移動反応を進行させるために、ルテニウム錯体(Ru(bpy)3)とその類縁錯体を光増感金属錯体として利用する。このような２つの設計指針をもとに、本研究ではCHTを初めとする幾つかの加水分解酵素について、その活性中心のセリン残基(CHTではSer195)に不可逆に導入し得る、ベンゼンスルホニルフルオリド基を有するRu(bpy)3型錯体類縁体の開発を行った。
これまでの研究経過として、Ru(bpy)3型錯体の合成に着手し、これら錯体の光物理特性評価を実施した後、CHT複合体を水溶液中で調製し、それらの光特性を原著論文として発表した段階にある。さらに、2, 2’-ビピリジン以外の配位子自身の光特性や光励起状態の安定化を系統的に検討することを目的として、種々の窒素含有配位子のプロトン付加体についての結晶構造解析や発光特性を調べた。これらの発光特性について実験的およびDFT計算による理論的アプローチから詳細に検討し、励起状態由来の発光機構を明らかにした。成果の一部については、学会発表や原著論文として学術雑誌に掲載している。
以上のような状況から、本年度計画の進捗状況はおおむね順調といえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はさらに、先に調製したキモトリプシン-ルテニウム錯体複合体において、その多段階光電子伝達反応システムを構築する。反応の観測は、レーザー光源を用いた、高速時間分解分光測定により実施する。実験方法として、電子受容体としてメチルビオローゲン(MV2+)を共存させ、Ru(bpy)3型錯体の光励起に伴う過渡吸収スペクトル測定等から追跡し、光誘起電子伝達により生成するラジカル種を検出する。この反応では、Ru(bpy)3型錯体の光励起とMV2+への電子伝達により生成する一電子酸化されたRu錯体が、CHT内の例えば近傍に存在するチロシン(Tyr94)を候補として蛋白質内部空間を通した電子伝達を行う。その結果、チロシンラジカルを作り出すことが出来ると考えられる。これら素過程を観測することで、多段階電子移動反応速度と距離および経路の関係を速度論的に議論し、蛋白質内電子移動反応機構の詳細を明らかにしたい。
また、2, 2’-ビピリジン類縁の配位子は、そのパイ共役系拡張や電子供与性置換基の導入により、Ru錯体の発光量子収率の向上、3MLCT励起状態の安定化（酸化還元電位変化）をもたらすため、蛋白質複合体内での電荷分離効率の向上改善を、Ru錯体配位子のチューニング、混合化等によっても検討する。そこで、様々なRu錯体などを用いた蛋白質の二量化反応も行い、Ru錯体の3MLCT励起状態安定化による効率的なチロシンラジカル生成について検証する。
その後の計画期間では、生じたチロシンラジカルの反応性を評価する。系内にラベル化剤を添加し、Ru錯体への定常光照射によるチロシンのラベル化反応を進行させる。中間体であるチロシンラジカルとラベル化反応後の蛋白質を分光学的に定量的に観測し検証することを段階的に予定している。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額に相当する物品として、分析天秤を購入したが、年度をまたいでの納品となったため次年度使用額とするためである。翌年度分として請求している費用については、当初と変更なしの予定である。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Structures, DFT calculations and emission properties of protonated adenine, cytosine and guanine bases2020
Author(s)
Naokazu Yoshikawa, Shoko Yamazaki, Kana Kimori, Yuna Kakimoto, Kanako Mito, Shiori Eguchi, Risa Yokoyama, Nobuko Kanehisa, Norimitsu Tohnai, Eiji Nakata, Hiroshi Takashima
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Journal Title
Trends in Photochemistry & Photobiology
Volume: 19
Pages: 1-16
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