2020 Fiscal Year Research-status Report
発がんリスク指標DNA損傷体の分析における実用・定量性の追求と革新的感度の獲得
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20K05569
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| Research Institution | Gifu Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
江坂 幸宏 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (70244530)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | DNA損傷 / 発がんリスクマーカー / LC/MS/MS / CEオンライン濃縮/ESI-MS / 重水素化内部標準 / ESI効率 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．LC/MS/MSをプラットホームとする実用発がんリスク検査法の包括的開発
（１）イオン効率が良好なヌクレオシド(dX)及び、塩基（X）形態でのDNAからの抽出法開発： dX形態については、アセトアルデヒド損傷体(グアニン付加体)を、1時間で定量的に5’-dXMPに切り出すヌクレアーゼとしてBal31（後続するAPase処理で定量的にdXにする）を見出した。塩基形態での抽出では0.1 M HCl中、80℃、1時間の条件で完全な解離を確認した。（２）正常塩基からの選択的抽出を可能にする新規固相抽出剤の開発：効率的な損傷体回収のために核酸塩基で修飾したポリマー系固定相を合成して選択性の評価を行った。（３）移動相の組成によるESI効率の向上：dXおよびX形態でのESI効率の向上を検討した。脱溶媒の容易な有機溶媒組成の高い溶離液を用いるHILIC-ESI-MSにおいて検討を進め、溶媒にアセトトリル、ESI支援塩に重炭酸アンモニウムの選択により、水系、塩無添加条件に比して100倍程度のESI効率向上が達成された。（４）安価な同位体標準物質の作成：アセトアルデヒドの重水素化体を用い、重水中でGua, dG, dGMPと反応させてIS(アセトアルデヒド損傷体の重水素化体)を調製し、定量性、安定性の評価を行った。
２．キャピラリー電気泳動（CE）オンライン濃縮-ESI-MS検出による革新的絶対感度獲得
LDIS－ESI-MS法による損傷塩基分析法の開発：酸性条件下で損傷塩基をカチオン状態にして、大量注入電場増強スタッキングとtITPを組み合わせたLDIS法により1μLの試料から1000倍の集束濃縮を達成した。本法を理研、川井博士の協力でCE-シースレスESI-MS /MS装置を使って予備検討した結果、絶対感度で10アトモルレベルの損傷塩基の検出を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
LC/MS/MSシステムを用いた方法論の整備、開発については、計画通りに研究が進んでいる。即ち、①前処理法のうちDNAからの定量的な切り出しについては、ほぼ完成した。共存する正常体の除去については、すでに用いている自作の微小固相抽出デバイスStageTipの逆相系タイプを用いて許容レベルまでの除去性能は得られているが、さらに、分子認識によって損傷核酸塩基を高い選別能で回収できる固相の開発戦略として、核酸塩基で修飾した固相の開発をはじめることができ、最初のタイプの作成、評価を行っている。②dX, X形態でのESI-MS検出感度向上のため、ESI-MS装置の種類に関わらず、ESI効率を高められる移動相組成の検討を進め、溶媒としてアセトニトリル、ESI支援塩に重炭酸アンモニウムの選択、その濃度の最適化を完了した。③ESI-MS分析用の重水化ISの調製、評価を完了した。また、損傷塩基分析のための安価なIS調製の戦略の提示も行った。
CEオンライン濃縮－ESI-MSを用いた方法論の開発について。動電加給法ーPhosTag錯体化―ESI-MS法の自動化については検討を続けているが、複雑なプロセスの自動化が計画通り進まず、分析法として利用できる再現性、定量性、感度面においても良好な結果を得るに至っていない。一方、LDIS－ESI-MS法の方は、理研の装置の完成度が高いため、順調に検討が進み、標準試料の分析では、これまでで最高の絶対感度を達成している。定量性も高い。実組織としてウシ、ブタの肝臓の分析を行い、アセトアルデヒド由来の損傷体であるグアニン付加体の検出に成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．LC/MS/MSをプラットホームとする実用発がんリスク検査法の包括的開発：DNAからの損傷塩基の抽出法については、ほぼ解決しており、今後行う実分析に際して、必要な手直しを行う。正常塩基を効率的にのぞく固相抽出法は、愛知工大の村上博哉博士の協力下でさらに検討を進める。その際に、分析対象をDNA内の損傷体だけでなく、尿、唾液などの体液に排出、含有された損傷体（dX、XそしてdXMPも含める）にも広げ、生体試料マトリックスの除去も想定した処理を検討していく。ESI効率の上昇による感度向上については、ナノESI化を検討する。令和3年度中に、所有するESI-MS/MS機のSCIEX 3200QTRapのナノESIプローブを完成し、ナノESI化によるLC/MS/MSシステムでの最終的な高感度の獲得を目指す。また、損傷体の安価な重水素同位体標準物質の作成について、現在のアプローチは変異原物質の重水素体が得られる場合に限定される。そこで、デオキシリボースを重水素化したdGを岐阜薬科大学の佐治木弘尚教授の協力を得て調製し、これを損傷体ISの原料として評価して利用を検討する。
２．キャピラリー電気泳動（CE）オンライン濃縮-ESI-MS検出による革新的絶対感度獲得 ：EKS-錯体化-ESI-MSによる損傷ヌクレオチド分析法の自動化については、引き続き検討を行い、分析法として必要な再現性、感度、定量性の獲得を目指す。LDIS－ESI-MS法の方は、現在の方法を用いて、様々な実試料、特に将来のヒト検診を想定とした(動物)血液を対象とした、前処理から定量までの一連の分析を行う。その結果に基づき、必要な改良を行って、核酸損傷の超高感度検出法としての確立を行う。
３．CEオンライン濃縮-レーザー蛍光検出による革新的感度獲得：レーザー蛍光検出とCEオンライン濃縮で別の超高感度手法を開発する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍の状況になかで、外注によるナノESIプローブの発注を行うことができなかった。また、3200QTrap用のロータリーポンプ(80万円）を購入予定であったが、これは別予算で購入できたので、DNA損傷体の新しい高感度検出系としてレーザー蛍光システムを導入する計画を立案したが、これもコロナ禍で外注が進まなかった。学会開催がすべてＷｅｂ開催となり、旅費（5万円）が執行されなかった。その他で予定していた機器の修理も同様の理由で先送りした。以上の理由で、令和3年度使用額（Ｂ－Ａ）の額がやや多くなった。
R2年度に計画したナノESIプローブ、レーザー蛍光システムは、令和3年度以降に導入することとした。また、予定していた機器修理も令和3年度以降に実施することとした。
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